微清蛋白中间神经元在氯胺酮抗抑郁中的作用

张广芬，张明强，孙合亮，李强，于颖群，周志强

1.南京军区 南京总医院麻醉科，江苏 南京 210002；2.解放军第307医院 麻醉科，北京 100071

近年来大量临床研究和动物实验均表明，全麻药氯胺酮具有快速有效抗抑郁作用，但其具体作用机制尚不明确[1-3]。研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体阻断后，微清蛋白（parvalbumin，PV）中间神经元抑制功能下调，导致谷氨酸（Glu）信号系统去抑制[4-6]。鉴于Glu信号系统增强是氯胺酮抗抑郁的关键步骤[2,7]，我们推测氯胺酮可能通过阻断PV中间神经元上的NMDA受体，介导Glu信号系统去抑制，进而产生抗抑郁作用。在本实验中，我们观察了PV中间神经元在氯胺酮抗抑郁中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性Wistar大鼠，体重200～250 g，由南京军区南京总医院比较医学科提供，实验动物合格证书编号为0016766。在室温25℃、相对湿度为45%的动物房适应性饲养1周，自由饮水，标准饮食。

1.2 实验分组及给药

采用随机数字表法将大鼠均分为4组（n=8）：生理盐水组（S组）、氯胺酮（福建古田制药厂，批号：20110301）组（K组）、夹竹桃麻素（Sigma公司）预处理+生理盐水组（AS组）、夹竹桃麻素预处理+氯胺酮组（AK组）。大鼠行强迫游泳15 min制备急性应激抑郁模型。夹竹桃麻素预处理组将药物溶于大鼠饮水中，每天5 mg/kg，共喂养1周，于第8 d制备模型。模型制备后24 h大鼠腹腔注射1 mL生理盐水或氯胺酮（10 mg/kg）。

1.3 敞箱实验（open field test，OFT）

生理盐水或氯胺酮给药后0.5 h应用OFT进行大鼠自主活动评分，由2名经过培训的实验人员根据评分标准进行盲法测评，取平均分。实验在一个底面积75 cm×75 cm并均分为25个方格，高40 cm，没有顶盖的敞箱内进行。每只大鼠被放在敞箱的中央格，手动记录大鼠在5 min内的各项得分：水平得分，为大鼠水平穿越的方格数，大鼠3或4只脚爪都进入一格记为1分；垂直得分，2只前爪每离开底面一次记为1分。实验环境安静，清洁敞箱后进行下一只大鼠的测试。

1.4 强迫游泳实验（forced swimming test，FST）

采用大鼠FST建立急性应激抑郁模型，即将大鼠置于高65 cm、直径30 cm、盛有23～25℃自来水的玻璃缸中，水深40 cm，游泳15 min。OFT测试后即刻将大鼠置入玻璃缸中行FST 6 min，观察并记录后5 min大鼠的不动时间。行为学测试由2名经过培训的实验人员根据评分标准进行盲法测评，取平均值。清洁玻璃缸后进行下1只大鼠的测试。

1.5 Western印迹检测PV及谷氨酸脱羧酶67（GAD67）的表达

大鼠用戊巴比妥钠60 mg/kg于腹腔注射麻醉后经左心室快速灌注4℃的生理盐水200 mL，剥离前额皮层组织匀浆离心，取上清分装并保存在-80℃冰箱中待用。用Bradford法测定蛋白浓度，电泳分离，转膜。用封阻液室温封阻2 h，将NC膜放入自封袋中，加PV（兔抗大鼠，1∶200）、GAD67（小鼠抗大鼠，1∶100），密封，垂直平面上缓慢旋转摇动，4℃孵育过夜，TBST漂洗，用HRP标记的二抗（羊抗兔/小鼠，1∶2000）室温孵育3 h，TBST漂洗，再用TBS洗5 min，用ECL试剂反应，曝光显影，图像扫描后采用Image J分析软件，以目的蛋白与内参β-actin灰度值的比值反映蛋白表达水平。

1.6 统计学分析

计量数据以x±SEM表示，采用SPSS 16.0软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氯胺酮对大鼠OFT水平运动及垂直运动的影响

4组大鼠水平运动及垂直运动均无显著差异（P＞0.05），结果见图1。

2.2 氯胺酮对大鼠FST不动时间的影响

与S组相比，K组大鼠FST不动时间明显减少（P＜0.05），AS组无显著差异（P＞0.05）；与K组相比，AK组大鼠FST不动时间明显增加（P＜0.05）（图2）。

2.3 氯胺酮对大鼠前额皮层PV及GAD67表达的影响

与S组相比，K组大鼠PV及GAD67的表达明显减少（P＜0.05），AS组无显著差异（P＞0.05）；与K组相比，AK组大鼠PV及GAD67的表达明显增加（P＜0.05）（图3）。

3 讨论

PV中间神经元为γ-氨基丁酸（GABA）能中间神经元，在调节锥体细胞的活动中起着重要作用。研究表明，PV中间神经元的功能下调在氯胺酮致精神分裂样表现中发挥重要作用[4-5]。然而，在氯胺酮抗抑郁中PV中间神经元是否亦发挥作用尚不清楚。本研究观察到氯胺酮10 mg/kg具有明确的抗抑郁效果，能显著减少强迫游泳大鼠不动时间，夹竹桃麻素预处理能阻断氯胺酮的这种抗抑郁作用；氯胺酮给药后0.5 h大鼠大脑前额皮层PV中间神经元中PV及GAD67的表达显著下降，夹竹桃麻素预处理后能阻断氯胺酮所致PV及GAD67表达的下降。

图1 氯胺酮对大鼠敞箱实验水平运动及垂直运动的影响

图2 氯胺酮对大鼠强迫游泳实验不动时间的影响

图3 氯胺酮对大鼠前额皮层PV及GAD67表达的影响

前额皮层在抑郁症等情感障碍中发挥重要作用，是研究氯胺酮抗抑郁机制常涉及到的脑区，故本研究选取大鼠前额皮层作为检测区域[2-3]。Li等[2-3]研究表明，氯胺酮快速有效的抗抑郁作用依赖于磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的快速上调，进一步导致下游信号通路的激活，从而促使突触蛋白及突触数量的增加，然而氯胺酮导致mTOR信号通路增强的潜在机制仍不清楚。以往研究证实，Glu能-α-氨基羟甲基恶唑丙酸（AMPA）受体活化在氯胺酮导致的mTOR信号通路增强中发挥重要作用[8]。本研究发现，氯胺酮能够导致大鼠前额皮层PV中间神经元抑制功能下降，这可能促使Glu信号系统去抑制，从而发挥抗抑郁作用。

还原型辅酶Ⅱ（NADPH）抑制剂夹竹桃麻素能减少超氧化物的产生，阻断氯胺酮所致PV及GAD67的表达下降[4]。因此，我们选用夹竹桃麻素预处理，结果表明这种预处理能够阻断氯胺酮的抗抑郁作用及其所致PV及GAD67蛋白表达的下降，进一步表明PV中间神经元在氯胺酮抗抑郁中发挥重要作用。

综上所述，本研究结果提示，PV中间神经元在氯胺酮抗抑郁过程中发挥重要作用，但其确切机制仍须进一步研究。

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