基于抗CD20单克隆抗体的2种夹心ELISA法的建立

邓承莲，董立厚，邹佳，宋海峰

1.广西医科大学，广西 南宁 530002；2.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，军事医学科学院药代动力学重点实验室，北京 100850

分子靶向治疗是近年来肿瘤治疗领域的研究热点，与传统化疗药物相比，这类药物具有靶向性、非细胞毒性、疗效明显等特点，主要对肿瘤细胞起调节和稳定作用[1-2]。作为治疗B细胞淋巴瘤的靶向药物，抗CD20单克隆抗体在治疗性抗体中占有重要的一席之地，因此，其药代动力学与毒代动力学研究也随之成为一大热点。

自1997年第一个抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗（rituximab）获准上市至今，该类药物发展迅速，根据其不同的结构、人源化程度及Fc段修饰等，大致经历了三代研发[3]。已报道的针对这类药物的检测分析方法主要为酶联免疫吸附分析法（ELISA）[4-5]，另外也有流式细胞法[6-7]和Gyros法[8]等。本研究中，我们选用重组抗CD20人源化单克隆抗体（rh-anti-CD20zumab）作为目标药物。该抗体是基于利妥昔单抗的结构经人源化改造而成，可通过与B细胞表面的CD20分子结合，经抗体依赖性细胞毒作用（an⁃tibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC）和补体依赖性细胞毒作用（complement dependent cyto⁃toxicity，CDC）等途径发挥抗肿瘤作用[9-10]。针对该抗体，我们建立了2种不同的夹心ELISA法用于定量检测生物基质中rh-anti-CD20zumab的浓度，并对其方法学进行较为全面验证，试图为后续的rh-anti-CD20zumab在食蟹猴体内的药代动力学研究提供不同的分析方法。

本研究中采用不同的分析方法进行药代动力学研究，得到的结果可以相互印证，从而可提高分析方法的准确性。同时，我们对2种方法进行了比较，为类似治疗性抗体的临床前药代动力学研究提供了不同的研究路线，不同实验室可根据自身试剂的获取难易程度而选择不同的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料

rh-anti-CD20zumab（批号：20121101，纯度＞98%，上海医药集团有限公司）；山羊抗人IgG F(ab')2抗体（批号：104172，Jackson ImmunoResearch公司）；驴抗人IgG Fc抗体（批号：105065，Jackson Im⁃munoResearch公司）；HRP标记的猴血清吸附的山羊抗人IgG多克隆抗体（批号：A80-319P-15，Bethyl公司）；小鼠IgG（批号：ab37355，Abcam公司）。

96孔酶标板（Nunc公司）；微量加样器（Brand公司）；洗板机（Thermo公司，型号为4MK2）；酶标仪（Thermo公司，型号为MK3）。

1.2 捕获抗体为山羊抗人IgG F（ab'）2抗体的夹心ELISA法

①包被：用山羊抗人IgG F（ab'）2抗体包被酶标板，100 μL/孔，4℃静置过夜后用洗板液洗板3次；②封闭：以1%I-Block为封闭液，300 μL/孔封闭反应2.5 h，用洗板液洗板3次；③加样：用100%食蟹猴空白血浆将rh-anti-CD20zumab标准品梯度稀释至10 000～20 ng/mL，另用同样方法单独配制浓度为3750、1500、100 ng/mL的质控样品；用稀释液（PBS缓冲液加0.5%Tween-20和1 mol/L NaCl）对所有血浆样品进行1∶20前处理，每个前处理后的样品以100 μL/孔加入酶标板中，每个样品设2个复孔，室温孵育2.5 h，用洗板液洗板3次；④加酶标二抗：加入25 ng/mL HRP标记的猴血清吸附的山羊抗人IgG抗体，室温孵育55 min，用洗板液洗板6次；⑤显色与测定：加入TMB避光显色15 min，1 mol/L硫酸终止显色，酶标仪比色读取D450nm值。

1.3 捕获抗体为驴抗人IgG Fc抗体的夹心ELISA法

①包被：用驴抗人IgG Fc抗体包被酶标板，100 μL/孔，4℃静置过夜后用洗板液洗板3次；②封闭：以 1%I-Block为封闭液，300 μL/孔，封闭反应3 h，用洗板液洗板3次；③加样：用100%食蟹猴空白血浆将rh-anti-CD20zumab标准品梯度稀释至25 000～20 ng/mL，另用同样方法单独配制浓度为10 000、4000、110 ng/mL的质控样品；用稀释液（同上）对所有血浆样品进行1∶10前处理，每个前处理后的样品以100 μL/孔加入酶标板中，每个样品设2个复孔，室温孵育3 h，用洗板液洗板3次；④加酶标二抗：加入30 ng/mL猴血清吸附HRP标记的山羊抗人IgG抗体，室温孵育55 min，用洗板液洗板6次；⑤显色与测定：加入TMB避光显色15 min，1 mol/L硫酸终止显色，酶标仪比色读取D450nm值。

2 结果

2.1 特异性

考察结构类似物小鼠IgG对2种方法的干扰情况。按照制备标准曲线的方法制成高浓度质控样品和低浓度质控样品，并使其中含有10倍或1倍定量上限（ULOQ）浓度的小鼠IgG。捕获抗体为山羊抗人IgG F（ab'）2的夹心ELISA法中，在高、低质控样品中均分别加入50 000和5000 ng/mL的小鼠IgG后，rh-anti-CD20zumab的平均分析回收率（%AR）分别为122.5%和122.1%、107.6%和107.1%。捕获抗体为驴抗人IgG Fc抗体的夹心ELISA法中，在高、低质控样品中均分别加入250 000和25 000 ng/mL的小鼠IgG后，rh-anti-CD20zumab的平均分析回收率分别为114.4%和106.9%、81.5%和81.5%。这表明在猕猴血浆中存在50 000 ng/mL（包被抗体为山羊抗人IgG F（ab'）2抗体）和125 000 ng/mL（包被抗体为驴抗人IgG Fc抗体）的小鼠IgG时，均不会影响待测抗体的准确性，但后者优于前者。

2.2 标准曲线和线性范围

用100%食蟹猴血浆配制标准曲线，批间重复5次。标准曲线采用相同浓度下各批回算平均值之间的变异系数（CV）和相对误差（RE）来评价。结果见图1。2种方法的CV分别小于7.3%和11.1%，RE分别为-16.5%～13.2%和-4.4%～3.9%，均满足生物技术药物的药代动力学要求，标准曲线均具有良好的线性和重现性。2种方法的线性范围分别为40～5000和40～12 500 ng/mL，具有相同的灵敏度，但捕获抗体为山羊抗人IgG Fc抗体的夹心ELISA法的线性范围更宽。

2.3 准确度和精密度

不同实验日期进行5批样品验证，结果见表1。捕获抗体为山羊抗人IgG F（ab'）2抗体的夹心ELISA法中，各级别验证样品的准确度RE为-10.3%～16.6%，板内和板间精密度CV≤16.2%；捕获抗体为驴抗人IgG Fc抗体的夹心ELISA法中，各级别验证样品的准确度RE为-14.4%～12.9%，板内和板间精密度CV≤19.4%，均符合方法学确证要求，两者相近。

2.4 稀释线性和钩状效应

考察样品稀释对样品浓度检测准确度的影响。捕获抗体为山羊抗人IgG F（ab'）2抗体的夹心ELISA法中，根据实验需要分别用100%食蟹猴空白血浆配制浓度分别为250 000、25 000、6000 ng/mL的样品溶液，考察稀释率为1/1000、1/500、1/50、1/5和1/2的稀释效应；捕获抗体为驴抗人IgG Fc抗体的夹心ELISA法中，根据实验需要分别用100%食蟹猴空白血浆配制浓度分别为200 000、20 000、8000 ng/mL的样品溶液，考察稀释率为1/500、1/100、1/50、1/5、1/2的稀释效应。结果见表2。将已知浓度的rh-anti-CD20zumab标准品稀释至不同浓度，2种方法的RE分别小于18.6%和13.3%，均符合方法学确证要求，但后者优于前者。

考察2种方法是否具有钩状效应。捕获抗体为山羊抗人IgG F（ab'）2抗体的夹心ELISA法中，考察3 000 000、300 000、30 000、3000、300 ng/mL浓度点，结果表明D450nm值随着样品浓度的增加而增加，在3 000 000～300 ng/mL范围内没有出现钩状效应；捕获抗体为驴抗人IgG Fc抗体的夹心ELISA法中，考察 3 000 000、300 000、30 000、6000、1200 ng/mL浓度点，结果表明D450nm值随着样品浓度的增加而增加，在3 000 000～1200 ng/mL范围内没有出现钩状效应。

3 讨论

图1 2种ELISA法测定的标准曲线（n=5）

表1 2种ELISA法的精密度和准确度（n=5）

免疫学分析方法包括ELISA、放射免疫测定（RIA）和荧光免疫分析（IFA）等，其中ELISA为公认的较为快捷灵敏的方法[4]。本研究中，我们以重组抗CD20人源化单克隆抗体作为待测物，分别选用抗人IgG F（ab'）2抗体和抗人IgG Fc抗体作为捕获抗体，建立了2种灵敏高效的夹心ELISA法，试图为后续rh-anti-CD20zumab在食蟹猴体内的药代动力学研究提供不同的分析方法。其中，捕获抗体为抗人IgG F（ab'）2抗体的双抗体夹心ELISA法中，捕获抗体针对的是rh-anti-CD20zumab 的 F（ab'）2段；捕获抗体为抗人IgG Fc抗体的双抗体夹心ELISA法中，捕获抗体针对的是rh-anti-CD20zumab的Fc段。结果表明，对于配制在全血浆基质中的药物而言，这2种分析方法的灵敏度、精密度、准确度、特异性、稀释线性等各项验证指标均符合药代动力学研究的要求。虽然两者的灵敏度、精密度和准确度相同或相近，但后者的线性范围更宽，并且稀释线性和特异性更好。整体来说，后者优于前者，2种分析方法均可用于rh-anti-CD20zumab的临床前药代动力学研究，并且也为其他类似抗体的药代动力学研究提供了2条合适的研究路线。

[1]张迪,戈伟.肿瘤分子靶向治疗进展[J].武汉大学学报（医学版）,2011,32(5):705-708.

[2]韩慧珍，邹庞,郭宝良.分子靶向治疗药物的研究进展[J].中国普通外科杂志,2010,19(12):1342-1346.

[3]邓承莲,邹佳,宋海峰.抗CD20治疗性单克隆抗体的研究进[J].药学学报,2013,48(10):1515-1520.

[4]Damen C W,Schellens J H,Beijnen J H.Bioanalytical meth⁃od forthe quantification oftherapeutic monoclonalantibod⁃ies and their application in clinical pharmacokinetic studies[J].Hum Antibodies,2009,18(3):47-73.

[5]刘若瑞,陈知航,许先兴,等.重组抗CD20单克隆抗体ELISA检测新方法[J].生物技术通讯,2011,22(2):220-224.

[6]Beum P V,Kennedy A D,TaylorR P.Three new as⁃says for rituximab based on its immunological activity or anti⁃genic properties:analyses of sera and plasmas of RTX-treat⁃ed patients with chronic lymphocytic leukemia and other B cell lymphomas[J].J Immunol Methods,2004,289(1-2):97-109.

[7]董增祥,王清清,陈立慧,等.两种基于RAJI细胞的抗CD20单抗新型定量方法的比较及在药物代谢动力学中的应用[J].分析化学,2009,37(10):1457-1462.

[8]Liu X F,Wang X,Weaver R J,et al.Validation of a gyro⁃lab assay for quantification of rituximab in human serum[J].J Pharmacol Toxicol Methods,2012,65(3):107-114.

[9]Boross P,Leusen J H.Mechanisms of action of CD20 antibod⁃ies[J].Am J Cancer Res,2012,2(6):676-690.

[10]Robak T,Robak E.New anti-CD20 monoclonal antibodies for the treatment of B-cell lymphoid malignancies[J].Biodrugs,2011,25(1):13-25.