微生物细胞色素P450与胆固醇的生物代谢

马婧，杨秀清，曾令丹，魏玲

山西大学 生物技术研究所，山西 太原 030006

1 细胞色素P450概述

细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是一个含铁血红素和硫羟基的单加氧酶蛋白超家族，能在温和条件下把底物中反应惰性的碳氢键氧化，从而使底物发生氧化。CYP450广泛分布在动物、植物、低等真核生物和细菌体内，在同种生物的不同组织中都存在，是自然界中含量最丰富、底物谱最广的催化酶系。

CYP450是以硫醇盐结合血红素为活性中心催化氧原子转移的氧化还原酶，氧需由亚铁血红素（HEM）来活化。位于活性中心（HEM）的铁离子一边和半胱氨酸的硫络合，另一边和水的氧分子络合。CYP450中绝对保守的半胱氨酸残基与催化活性中心亚铁血红素中铁元素形成硫醇盐离子键，成为铁的一个配体[1]。这正是CYP450中的铁能与一氧化碳络合，并在450 nm存在特征吸收的原因，最初名称也由此而来[2]。

CYP450参与生物体内多种外源物质的代谢和内源物质的转化，如甾类激素、胆汁酸、药物、胆固醇、脂肪酸、毒素、前致癌剂等的生物代谢等，特别是在许多临床药物代谢中具有重要的生物学意义。

CYP450单加氧酶系是自然界中最具催化多样性的生物催化剂，可以催化的反应主要有：烷基的氧化、环氧化、羟基化，氧、硫、氨部位的脱烷基化，氨部位的羟基化和氧化，硫部位的氧化，氧化性脱氢、脱氨和脱卤素，氧化性的C-C键断裂，以及一些还原催化反应[3]。人类制造的药物、环境化合物等，大多是CYP450的可能底物，所以，多数CYP450酶都具有很宽的底物谱。

1.1 CYP450的命名及分类

目前，被命名的CYP450基因序列超过1万个，可根据氨基酸序列的同一性高低分类：氨基酸序列的同一性＞40%属于同一个家族（用阿拉伯数字表示），＞55%属于同一个亚家族（用大写英文字母表示），如CYP450 6C8、CYP450 76A3、CYP450 125B2等。CYP450 125B2，即CYP450第125个家族B亚族中第2个成员，通常可简写为CYP125B2。

根据催化反应中电子传递链的不同，即催化机制的不同，可将CYP450分为4种类型：Ⅰ类位于细菌及真核生物线粒体膜上，这类CYP450要求铁氧化还原蛋白和铁硫蛋白参与电子链的传递；Ⅱ类结合于内质网上，由核黄素单核苷酸参与电子链的传递，直接与其还原酶作用；Ⅲ类与其还原酶融合成一个多肽，从底物直接接受电子；Ⅳ类则从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）接受电子[4]。

1.2 CYP450的应用

CYP450被称为万能生物催化剂，由于其极强的催化能力、能催化多种类型的化学反应及对氧化位点的高度选择性等多方面的优势，引起化学、生物学、药学、环境学等众多领域研究者的兴趣。目前发现的人类CYP450酶有57种，约90%的临床药物都通过这些CYP450酶的代谢，这使得研究CYP450与药物代谢的作用很受重视。因此，CYP450在生物学和药学方面的应用更为突出。

1.2.1 药物设计及基因治疗 CYP450被广泛用于药物的前药设计和癌症的基因治疗方面。由于一些药物代谢的稳定性、细胞毒性，以及某些药物须在特定部位、或须长时间发挥药效等，药物需要被制成前药形式，经生物体内转化后发挥其功能。如被CYP450激活的环磷酰胺能明显抑制肿瘤增殖，并能很好地避免药物毒性[5]；降压药氯沙坦需要CYP2C9和CYP3A4的参与，在生物体内转化为E-3174后才能发挥疗效；而CYP2C19则参与抗疟药氯胍，代谢成环氯胍，发挥抗疟作用。

1.2.2 新药物靶标 由于CYP450一些特异的催化反应而成为新药开发的作用靶标。如治疗乳腺癌细胞增殖的关键在于减少雌激素的生成，而抑制CYP19A的催化活性可有效减少雌激素的转化，成为治疗乳腺癌的新途径，目前已有多个CYP19A的抑制剂药物应用于临床[6]；再如，抗真菌药物的靶标CYP51、戒烟类药物开发的潜在靶标CYP2A6等。

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1.2.3 药物先导物检测 在药物研发早期，CYP450被用来检测药物先导物的代谢性质，这样既可以提高药效，缩短药物研发周期，节约研发成本，也避免了可能的药物-药物间相互作用，而且可以根据检测来对药物进行定向改造和结构优化，以提高药物代谢稳定性和生物利用率，并且也能降低药物的毒性。

当然，CYP450还可用于化工领域，作为化工原料和化学中间体。如CYP2A6就是一个催化氧化吲哚成为靛蓝的非常好的催化剂[7]。CYP450也可用于环境监测和保护中，作为环境污染的指示剂，利用污染物浓度对CYP450酶活性（抑制或诱导）的定量关系来检测环境污染的程度，判断环境状况。CYP450还能代谢多环芳烃及多卤代物等难降解的环境污染物，在生物除污、生物净化等方面也具有重要意义[8]。

2 胆固醇及其微生物代谢研究

胆固醇又称胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物，是自然界存在最丰富的甾醇化合物，广泛存在于动物体内，特别是哺乳动物如人体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中的含量也高，是人类重要的脂类物质之一。胆固醇还是膜、血浆脂蛋白的重要组成成分，是许多具有特殊生物活性物质，如胆汁酸、类固醇激素、维生素D3等的前体之一。

尽管胆固醇在人体内有着广泛的生理作用，但当其积累过量时便会导致高胆固醇血症、动脉粥样硬化、静脉血栓等疾病的发生，会对机体产生不利的影响。此外，血清胆固醇水平的提高也是引发冠心病的主要危险因素之一。因此，近年来对胆固醇的代谢和调控的研究也日益增多。

关于胆固醇代谢的报道大多是人体的CYP450降胆固醇的体外和体内研究进展。关于微生物代谢胆固醇的研究相对较少。但随着微生物代谢胆固醇的优势日渐突出，越来越多的研究者将目光集中到微生物代谢上来。

微生物代谢胆固醇的途径很多。据报道，某些益生菌的主要益生功能之一便是降解胆固醇。一系列体外研究提出了益生菌降胆固醇的可能机理，主要包括：游离胆酸盐与胆固醇的共沉淀作用，细菌的酶对胆酸盐的去结合作用，胆固醇在细菌细胞膜或壁上的结合，细菌对胆固醇的吸收、共沉淀作用的同时发生等。但是，目前益生菌去除胆固醇的机理并没有定论，益生菌在人体内作用的机理报道更少，临床研究存在样本小、服用剂量大、实验期限短、降胆固醇效果不稳定等问题，因此进一步的研究将集中于相关机理和临床研究上[9]。

鉴于上述原因，研究人员又针对微生物CYP450代谢胆固醇的催化途径进行了深入探讨。目前，微生物对甾醇的降解在诺卡菌、分枝杆菌和红球菌中的某些菌株中的研究已达到生化分子水平。研究显示，微生物降解胆固醇包括胆固醇的侧链降解和固醇环的打开两个过程，但这两个过程的先后次序尚未明了，而且在不同物种间也有所不同。通常，胆固醇3β-羟基部分氧化和Δ5异构化生成Δ4被认为是是胆固醇降解的开始。这种转化是由胆固醇氧化酶或3β-类固醇脱氢酶催化完成的，生成4-胆甾烯-3-酮；而后，4-胆甾烯-3-酮进一步转化，发生侧链C26的羟基化，从而引起胆固醇侧链的降解，或环A环B的氧化，生成2-六羟基-2，4-二烯-羧基酸；最后，C26-羧基酸进一步氧化，生成C22-羧基酸中间体、丙酰-CoA和乙酰-CoA[10]。可见，在胆固醇代谢过程中，中间体4-胆甾烯3-酮的C26羟基化对整个降解途径起到关键作用，而催化这一关键步骤的酶便是CYP450家族的CYP450 125（CYP125）。

3 CYP125在微生物代谢胆固醇中的关键作用

3.1 结核分枝杆菌中CYP125代谢胆固醇

随着基因组测序的发展，人们发现的CYP种类也越来越多，迄今细菌中己有900种CYP450被鉴定，其中部分物种的CYP450数量己明确。典型的放线菌基因组包括20种CYP450的编码基因，可编码多种CYP450。如耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis MC2 155）中有 39种CYP450，结核分枝杆菌（M.tuberculosis H37Rv）中有20种CYP450。在众多CYP450中，CYP125对胆固醇代谢的起始起到关键作用。

CYP125在结核分枝杆菌中的编码基因属于胆固醇降解基因簇的一部分[11]。编码胆固醇降解的基因簇在一些放线菌中是保守序列，包括非致病性的土壤细菌红球菌Rhodococcus jostii RHA1。该基因簇的功能表达需要胆固醇（底物）的介入，而后负责降解甾醇侧链，或环A和环B[12-13]。对胆固醇吸收和分解的动物感染和缺失突变研究显示，胆固醇的生物代谢对结核分枝杆菌的传播和耐药性都具有十分关键的作用[14-16]，并且在小鼠和巨噬细胞等模式生物中也得到了类似的结果，这表明结核分枝杆菌的致病性与胆固醇的生物代谢有很大的相关性[17-18]。

资料显示，CYP125虽与结核分枝杆菌的体内存活相关，而且它的分解代谢的催化活性已被证实，但它的生理学功能尚未明了，于是研究者进行了一系列实验。首先，以卡介苗（BCG）为模式生物与结核分枝杆菌的胆固醇代谢基因簇进行了比较；然后，对结核分枝杆菌H37Rv中CYP125基因进行了工程菌的异源表达，对得到的蛋白进行了分离纯化，并且通过气质联用等方法对CYP125酶的活性及性质进行了测定；最终得出CYP125参与催化了胆固醇代谢途径的起始步骤。

实验表明，CYP450催化胆固醇的降解主要是催化烷烃C-H键的羟基化及芳香环的氧化；CYP125是作为一类C26-羟基酶，通过对胆固醇侧链C26位的羟基化来起始胆固醇分解代谢的[10]。结核分枝杆菌CYP450在胆固醇代谢中的主要功能有：胆固醇的饱和侧链在进入结核分枝杆菌（β-氧化途径）前一定被化学功能化修饰，为β-氧化反应氧化侧链做准备，而后至少有4个阶段是必要的[19-20]。在前3个阶段，胆固醇的侧链被CYP450酶有序地催化氧化成末端醇、醛和酸。有3种结核分枝杆菌CYP450酶，即CYP125（Rv3545c）、CYP142（Rv3518c）和 CYP124（Rv2266）参与催化氧化胆固醇和4-胆甾烯-3-酮的侧链。最后，ATP-依赖阶段，通过固醇-CoA连接酶催化完成[21]。

3.2 红球菌中CYP125代谢胆固醇

在原核微生物对CYP450代谢胆固醇的催化途径方面，结核分枝杆菌属的研究居多，如今红球菌也加入到研究行列当中，如Rhodococcus DSM43269和R.jostii RHA1等。基因组序列数据分析表明，与其他原核生物相比，放线菌拥有相当数量的基因编码CYP450，如R.jostii RHA1约有29组基因编码其CYP450，尽管它们中绝大多数的生物功能未知，但其中的一些功能显示与甾醇类的生物代谢相关。

紫红红球菌（R.rhodochrous）DSM43269能在铁螯合剂的存在下选择性地降解甾醇侧链，抑制3-甾酮-9α-羟化酶（KSH）的活性。这种表型在缺乏KSH活性的多基因缺失突变株DSM43269（GR32）中稳定复制。突变菌株GR32完全阻断了甾醇的环降解，选择性地降解甾醇侧链，从而积累1，4-雄甾二烯-3，17-二酮（ADD）等代谢产物[10]。

迄今，参与甾醇侧链降解的基因尚未确定。在R.jostii RHA1中利用转录组学分析发现了一组胆固醇代谢的基因簇，包括2个CYP450编码基因。有趣的是，RHA1生长在胆固醇基质中时CYP125是一个高度上调基因，这也显示了这种酶在胆固醇代谢中的重要作用。在RHA1基因组中，CYP125的位置与预测编码的β-氧化酶的基因相邻，也就意味着将参与胆固醇的烷基侧链降解。

同结核分枝杆菌一样，研究者也构建了红球菌CYP125的工程菌，经菌体异源表达和蛋白分离纯化，再结合胆固醇及其类似物的一些相似性研究，并且经正常株和突变株的实验，对比得出细菌中胆固醇分解代谢的起始是侧链的氧化，而不是环的氧化。此外，CYP125在红球菌中也作为一种甾醇C26位的单加氧酶，参与了4-胆甾烯-3酮侧链的羟基化，即参与了胆固醇的起始代谢，是微生物体内胆固醇代谢的关键酶之一。

4 展望

CYP450单加氧酶引发研究者的极大兴趣在于它极强的生物催化能力，并参与众多生理生化过程，也在于它独特的催化作用机制，即将分子氧断裂并将其中一个氧原子插入底物。如前所述，CYP450这种独特的反应酶可应用于很多领域中。

自发现CYP450酶始，人们就开始尝试将各种具有特殊催化活性的CYP450异源表达于大肠杆菌等模式生物中，或通过传统的选育和细胞培养技术使CYP450酶可以用于生物氧化催化生产中。目前来说这2种方法都相当有效。但是有时由于动植物细胞培养困难，或野生型CYP450的表达量低、活力差等原因，很难直接应用到工业化生产领域，故需要对CYP450酶进行适当改造，如针对CYP450酶本身的改造、整个酶系统的杂交或重组、辅因子NAD（P）H循环系统效率的改善等。

我们已经知道，CYP450催化的药物生物转化是药物代谢中最重要的一个进程，该家族共有50多种同工酶，参与代谢90%以上人类常用药物。因此，细胞色素CYP450催化反应的机理的研究对制药行业有重大意义。绝大部分药物对人体而言都是异源体，最终都不能存在于人体内。在掌握CYP450介导的药物转化代谢途径后，可将CYP450用作药物靶标，有针对性地进行新药开发、剂型设计，以促进它们在体内快速代谢，这对临床用药方案的合理制定具有十分重要的指导意义。

CYP450作为生物界的“新宠儿”，其催化反应的条件、类型、机制等都已得到了广泛研究，但还有很多未知的挑战和颇具争议的难题摆在人们面前。对CYP450催化反应的研究还可以更深刻、更进一步，以便于能更好地对其生理活动进行调控，使其物尽其用，发挥最大的优势来造福我们的生活。

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