蛋白质组学在疾病研究中的应用

林虹君，张爱红，李高伟，吉会海，周学志

1.空军防化大队，北京 102206；2.防化学院，北京 102205

1984年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组（proteome）的概念[1]，即一个基因组在特定时刻表达的全部蛋白质。蛋白质组学（proteomics）是一门以蛋白质组为研究对象，以全面的蛋白质性质研究为基础，在蛋白质水平对疾病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探讨的科学。目前蛋白质组学的研究主要依赖三大技术：蛋白质分离技术、质谱技术和生物信息学。

1 蛋白质组学及主要技术

1.1 双向凝胶电泳技术（two dimensional polyacryl⁃amide gel electrophoresis，2D-PAGE）[2]

2D技术是目前蛋白质分离的主要技术。第一向电泳利用固相pH值梯度（immobilized pH gradi⁃ent，IPG）胶条进行等电点聚焦电泳，将不同等电点的蛋白质分离；第二向在第一向的垂直方向进行SDS-PAGE，从而将蛋白质根据其等电点和相对分子质量的差异在凝胶上分离成独立的蛋白质点。为避免不同凝胶之间的差异对结果分析带来的困难，发展了差异凝胶电泳技术（differential in-gel elec⁃trophoresis），将不同蛋白样品用不同激发波长的荧光标记后，在同一块胶上进行分离，保证了实验条件的一致性，有利于差异表达点的筛选。

1.2 质谱技术（mass spectrometry，MS）[3-4]

质谱技术是蛋白质组学的核心技术。将感兴趣的蛋白质点从凝胶上切下后，进行胶内酶切，将蛋白质降解为多肽片段，通过基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）或电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）技术使样品分子离子化，根据不同离子间的质荷比（m/z）的差异来分离并确定相对分子质量。在蛋白质组学中，目前最为常用的质谱分析系统包括两大类，即以单一质谱为基础的和以串联质谱为基础的。以单一质谱为基础的质谱分析系统以MALDI-TOF MS为代表，串联质谱以ESI-MS MS为代表。

MALDI-TOF MS[5-7]是将作为离子源的MALDI和分析检测飞行时间质谱连用。用一定波长的激光打在样品上，使样品离子化，然后在电场力作用下飞行，通过检测离子的飞行时间计算出其质量电荷比，从而得到一系列酶解肽段的分子质量或部分肽序列等数据，最后通过相应的数据库搜索来鉴定蛋白质。该技术精度高、分析时间短，可同时处理许多样品，是高通量鉴定的首选方法，常用于蛋白质的肽指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF）鉴定。ESI-MS MS[8-10]是在喷射过程中利用电场完成多肽样品的离子化，离子化的肽段转移进入质量分析仪，根据不同离子的质荷比差异分离，并确定分子质量。用此法分析肽混合物、鉴定蛋白质时，可对每一肽段进行序列分析，综合MS数据鉴定蛋白质，大大提高了鉴定的准确度。ESI-MS MS可检测出飞摩尔（fmol）数量级的样品，精确度可达0.005%。质谱还可用于翻译后修饰分析，如磷酸化、糖基化等。

1.3 生物信息学（bioinformatics）

生物信息学是生物学与计算机技术、应用数学、网络技术等结合建构起来的一门新兴学科[11-12]。它将大量系统的生物学数据与数学和计算机科学的分析理论和实用工具联系起来，通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析，达到解释数据所蕴含的生物学意义的目的。生物信息学在蛋白质组学研究中的作用主要有两个方面：一是分析和构建双向电泳数据库、蛋白质质谱分析数据；二是搜索与构建蛋白质组数据库。随着蛋白质组研究的推广，全球建立的与蛋白质相关的数据越来越多。已经建立的如Medline、PDB等数据库，包括了人血浆、尿液、脑脊液、正常组织和肿瘤组织及各种微生物的蛋白质图谱。生物信息学是蛋白质组学技术的重要组成部分，Swissprot是世界上使用最广泛的蛋白质序列数据库，能提供多种蛋白质数据，如蛋白质功能、结构域结构、翻译后修饰等。质谱鉴定得到的有关蛋白质数据，可以通过软件在数据库中查找匹配的可能蛋白质。

2 蛋白质组在疾病研究中的应用

蛋白质组学的发展对于疾病的研究非常及时，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明疾病在生理或病理条件下的变化机制。

2.1 蛋白质组学技术在心血管疾病研究中的应用[13]

心脏蛋白质组学研究主要涉及心肌病、心脏衰竭、心肌缺血、慢性应激、心脏衰老等。心肌病尤其是扩张型心肌病蛋白质组学研究最受关注，主要是分析病变心肌与正常心肌组织或细胞的差异蛋白质组，包括肌球蛋白轻链2（MLC2）、结合蛋白等细胞骨架蛋白，ATP合成酶、肌酸激酶、泛素C端水解酶等与线粒体能量产生相关蛋白，及热激蛋白HSP60、HSP70等应激相关蛋白。对心肌缺血保护机制的研究主要集中于对蛋白激酶C（PKC）功能蛋白质组学的探讨。应用蛋白质组学技术研究心脏衰老保护机制的性别差异，发现心脏中糖酵解和线粒体的代谢改变可能是心肌衰老的机制。慢性抑制应激状态可诱发心功能不全及心肌病，应用2DE-MS探讨与应激损伤有关的线粒体蛋白，发现慢性抑制应激状态的心肌线粒体与对照组相比有11个差异蛋白点，鉴定出5个蛋白表达减少，且与Krebs循环和脂质代谢有关。

2.2 蛋白质组学技术在肝病研究中的应用[14-16]

由于蛋白质组学研究更接近生命现象的本质，并在药靶研究中具有潜在价值，所以已被广泛用于疾病相关研究。在肝脏研究领域，蛋白质组学可用来研究肝脏的生理与病理、肝脏发育及肝脏疾病等，主要肝脏疾病包括肝脏肿瘤，肝硬化，毒、药物肝损伤等。肝硬化是一种或多种病因长期或反复作用造成的弥漫性肝脏损伤，其中肝星状细胞的活化是启动肝纤维化进程的关键环节。受损的肝细胞、邻近的内皮细胞、枯否细胞及肿瘤细胞和血小板都可激活肝星状细胞，促其合成大量细胞外基质。因此，肝星状细胞也成为肝硬化相关的蛋白质组学研究的目标。Kawada等通过对大鼠星状细胞的蛋白质组分析，发现了一种新蛋白STAP（stellate cellactivationassosiated protein），它只在星状细胞中被检测到，在纤维化肝中分离到的体内激活星状细胞和体外原代培养的活化星状细胞中高表达，可能通过清除过氧化物发挥抗肝纤维化的作用。

Kristensen等对比了静态和激活的大鼠肝星状细胞，发现有27种蛋白在体内和体外激活的星状细胞中都有相同表达变化，其中钙周期蛋白、calgizza⁃rin、半乳糖凝集素1上调，肝羧酸酯酶10、丝氨酸蛋白酶抑制物3下调，还列出了150余种星状细胞蛋白，从而加深了在蛋白质水平对星状细胞活化这一肝纤维化关键事件的认识。随着肝脏疾病蛋白质组学研究的不断深入，将会不断产生新的和更权威的具有诊断潜能的生物分子靶标，通过分析和监视相应蛋白质的变化，能及时掌握患者病程特点和进展趋势，对于患者的个体化治疗具有重要价值；更有意义的是，早期发现这些预警分子不仅有助于临床诊断治疗肝脏疾病，甚至可以发现患病的高危人群，及早采取相应措施，从而做到防患于未然。

2.3 蛋白质组学在胰腺疾病研究中的应用[17]

胰腺疾病的发生是机体正常细胞在多因素、多基因作用下发生转变的结果。在这一病变过程中，环境因素或遗传因素最终都必须通过基因及其相应的蛋白质发挥作用。在人类基因组计划的推动下，人们在基因水平对胰腺的发生发展进行了广泛研究，但基因的功能活动最终靠蛋白质体现。蛋白质组学在胰腺疾病研究中常用的样品为胰腺组织、胰液及血清。样品处理的好坏是双向电泳及质谱分析成功与否的关键，也是影响分辨率及重复性的主要因素。胰腺是体内含各种蛋白酶最丰富的组织，因此，胰腺组织中的蛋白质组分比其他组织更容易被蛋白酶降解，样品处理涉及到溶解、变性和还原，从而能去除蛋白质之间的相互作用。标本的采集从活体到离体的时间应尽量短，然后立即置于液氮中或含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中。蛋白酶对蛋白质的降解作用很强，并能够对蛋白质进行化学修饰，易使图谱中蛋白质点的数量和位置发生改变，因此使用足够的蛋白酶抑制剂，可使蛋白酶对蛋白质的水解作用的影响减小到最低程度，蛋白酶抑制剂含量比处理其他组织略多，这是保证胰腺蛋白质组分稳定的关键步骤。采用2-DE和MALDI-TOF MS测定人体正常胰腺组织蛋白质，共检测出302种蛋白质，其中27%为具有催化活性与代谢相关的酶类，19%是结构和细胞骨架蛋白，11%是与氧化应激相关的蛋白质，还包括5%热激蛋白、5%核功能蛋白和4%信号转导相关蛋白等。其中胰石蛋白、胰腺炎相关蛋白（PAP）仅在胰腺组织中表达，前者的功能与胰腺结石形成有关，PAP的功能不明。另外，通过信号转导系统蛋白的分析，胰腺的主要信号转导可能与GTP酶、穿膜受体蛋白、细胞间G蛋白、酪氨酸激酶系统等有关。对正常胰腺2-DE的蛋白质谱分析，可对胰腺组织蛋白质分析的条件进行优化，同时也为胰腺疾病的蛋白质组学研究提供一定的基础。

作为一种全新的研究手段，蛋白质组学便于在更为全面完整的高度探讨胰腺疾病的发病机理和治疗机制，为胰腺疾病的早期诊断和有效治疗提供有力的理论依据和新思路。但是，目前的研究方法还存在不足之处，如低丰度蛋白质检测的局限性、血清样品大分子蛋白质的有效去除、质谱和数据搜索引擎尚不能完整考虑氨基酸的修饰，以及检测费用昂贵等，这对蛋白质研究提出了新的挑战。

2.4 蛋白质组学在自身免疫性疾病中的应用[18]

自身免疫性疾病是机体对自身成分发生免疫应答而导致的疾病状态，可分为器官特异性自身免疫性疾病和全身性自身免疫性疾病。器官特异性自身免疫性疾病患者的病变局限于某一特定的器官，由对器官特异性抗原的免疫应答引起。全身性自身免疫性疾病，又称系统性自身免疫性疾病，其病变可见于多种器官和组织。自身抗体和（或）自身反应性T淋巴细胞介导的对自身成分发生的获得性免疫应答是自身免疫性疾病发生的原因。然而，在这些器官特异性和系统性自身免疫性疾病中，大多数疾病的发病机制还不十分清楚。蛋白质组学的出现，为探讨自身免疫性疾病的发病机制提供了有力工具。

Ⅰ型糖尿病是一种器官特异性自身免疫性疾病，在遗传易感性的基础上，绝大部分胰岛B细胞被自身免疫反应所破坏，从而引起胰岛素分泌不足与血糖升高。Ⅰ型糖尿病病因不明，发病机制较为复杂，可能与多种因素有关。Purohit等通过SELDITOF技术检测Ⅰ型糖尿病患者和抗胰岛细胞自身抗体阴性的健康者的血清样本，利用单变量和多变量分析，试图寻找Ⅰ型糖尿病的标志物，共发现146个具有统计学差异的蛋白峰，为进一步筛选Ⅰ型糖尿病的诊断生物标志物提供了有力的基础。复发性多发软骨炎（RP）是一种全身性（系统性）炎症疾病，发病机制不完全清楚，有学者认为软骨相关成分的自身免疫可能与疾病发病有关。Tanaka等应用2-DE免疫印迹联合质谱的方法，用细胞提取蛋白作为抗原来源，检测到15种自身抗原，并进一步鉴定了其中的5种，这5种自身抗原相对自身抗体出现的频率依次是微管素α/6为91%、波形蛋白为46%、α-烯醇化酶为36%、钙网织蛋白为82%、胶原蛋白1/2为36%。数据显示，自身免疫反应并不受软骨相关成分的束缚，更准确地说，在RP中有多种自身免疫反应发生，进一步探讨了RP发病机制的原因。

蛋白质组学以其深入揭示疾病状态下机体内所有蛋白质表达规律的优势，在阐明自身免疫性疾病的特异抗原、抗体和分子机制方面表现出极大的潜力。随着蛋白质组学研究技术的日趋完善，现行的结构蛋白质组学必然向功能蛋白质组学过渡，为自身免疫性疾病的早期诊断、新药研发及疾病康复开辟新的思路。

3 结语

蛋白质组学是一门在蛋白质分子水平认识生命机制的新兴学科，目前它的许多理论和技术还处于实验室探索阶段，但已显示出可喜的应用前景。功能蛋白质组研究在医学领域的广泛应用具有巨大的潜力，在生物制药领域中也具有难以估量的应用前景。可能在不远的将来，人类将能全面了解人类疾病的发生、发展、转归机制，在揭示人类生命的奥秘方面获得重大进展。

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