非复制型痘苗病毒的生物学性状研究进展

庞聪，田厚文

中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所病毒病应急技术中心，北京 102206

痘苗病毒曾在人类消除天花的战役中起到关键作用，此后，它作为一种基因转移载体，被广泛用于针对多种感染性疾病，如艾滋病、流感、天花、疟疾、结核等，以及许多肿瘤，如黑色素瘤、非小细胞型肺癌、肾细胞癌、前列腺癌、直肠结肠癌、人乳头瘤病毒（HPV）相关宫颈癌、乳腺癌等的基因工程重组疫苗的研究[1]。为了提高痘苗病毒载体的安全性，科学家们又发展出了非复制型痘苗病毒或复制缺陷型痘苗病毒，它们是对痘苗病毒进行自然或基因工程减毒得到的在非允许细胞中无法有效复制的病毒株。非复制型痘苗病毒具备痘苗病毒的主要优点：①多种细胞嗜性；②可插入大的基因片段（至少25 kb）[2]；③痘苗病毒载体疫苗不需要进行蛋白纯化，可在短时间内大量生产，因此可以作为预防生物恐怖的储备疫苗。另外，近年来肿瘤治疗已从传统的手术疗法、放射疗法、化学疗法跨入免疫疗法时代，这促进了人们去研究如何利用病毒载体激发机体的免疫反应，以利用机体自身的免疫系统来对抗肿瘤。于是，非复制型病毒载体作为肿瘤的治疗性疫苗纷纷进入临床前和临床研究[1]。总之，以非复制型痘苗病毒为载体的重组疫苗在反恐和肿瘤治疗等领域具有广阔的应用前景。

在该领域，目前国际上主要应用的是改良痘苗病毒安卡拉株（modified vaccinia Ankara，MVA）和NYVAC；而国内具有代表性的是本实验室具有自主知识产权的复制缺陷型痘苗病毒天坛株（NTV）。MVA是将土耳其的一株天花疫苗株痘苗病毒安卡拉株在鸡胚成纤维细胞（CEF）中自然传代500次，丢失了15%的基因，包括免疫逃避和宿主范围相关基因形成的病毒株[3]；NYVAC为痘苗病毒哥本哈根株（vaccinia virus Copenhagen，VACV-Cop）的衍生株，它在后者基础上用基因工程技术人工删除了18个开放读框，包括宿主范围、毒力和致病性相关基因[4]；NTV是从我国用于天花预防接种的疫苗株痘苗病毒天坛株基因组中用基因工程技术人工选择去除了与宿主范围和毒力相关的26个基因，总长21 243个核苷酸，获得的复制缺陷型天坛株痘苗病毒[5]。

国际上，基于MVA和NYVAC的载体疫苗已大量进入临床研究[1]。为了发展基于我国具有自主知识产权的NTV载体疫苗，为未来针对各种感染性疾病和肿瘤的NTV重组疫苗的临床研究奠定理论和实验基础，有必要了解和比较NTV、MVA和NYVAC等非复制型痘苗病毒的生物学性状，明确痘苗病毒相关基因功能与生物学性状的关系。故我们拟从以下几方面对MVA、NYVAC和NTV生物学性状的现有研究资料进行总结和比较，为深入研究我国非复制型痘苗病毒天坛株的生物学性状提供参考。

1 基因组结构

作为痘病毒科脊椎动物痘病毒亚科正痘病毒属的一员，痘苗病毒的基因组为线状双链DNA结构。不同毒株之间的基因组大小略有差异，大体为180～200 kb。与痘病毒科其他成员相同，痘苗病毒基因组的中央通常为保守区，基因高度保守，编码必要的与病毒复制相关的蛋白；而两侧通常为非保守区，基因变异较大，编码与宿主范围等相关的蛋白。

图1 MVA、NYVAC和NTV的基因组结构示意图以VACV-Cop为参考，显示MVA、NYVAC和NTV各自缺失的基因；MVA和NYVAC的示意图来自文献［1］，NTV示意图参考文献［5，11］绘制，其中C1L～C19L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L～K3L为构建NTV时人工缺失（21.2 kb），其余基因是原痘苗病毒天坛株与VACV-Cop的天然差异

MVA、NYVAC和NTV各自的基因组结构见图1。其中，一个宿主范围基因C7L仅存在于MVA，而不存在于NYVAC和NTV；另一个宿主范围基因K1L在三者中都被缺失或破坏。有研究表明，C7L的功能与病毒晚期蛋白正确合成的控制和凋亡相关[6]，而C7L和K1L都能抑制蛋白激酶（PKR）的活性[6-9]，并抑制Ⅰ型干扰素引发的抗病毒活性[10]。可以推测，一些重要基因的存在或缺失是导致3株病毒生物学性状差异的重要原因。

2 体外生长特性

病毒的体外生长特性，如细胞嗜性，可以反映病毒细胞水平的宿主范围。判断病毒细胞嗜性的依据通常是，来自特异的组织或物种的细胞培养物是否能够允许、半允许或不允许某种病毒在其中完成复制，病毒能在其中躲避宿主防御而成功复制的细胞即是该病毒的允许细胞。参与决定和影响病毒细胞嗜性的基因通常称为病毒的宿主范围基因（host range gene）[12]。

根据现有资料，我国的复制缺陷型痘苗病毒天坛株在允许细胞CEF上繁殖良好且能有效传代；在非允许细胞2BS（人胚肺细胞）上不能繁殖和传代，在143TK-（人骨髓瘤细胞）上只能产生极低滴度的子代病毒，且在这2种人源非允许细胞上均不能形成与原痘苗病毒天坛株一样的典型病毒噬斑[5]。

一项关于MVA和NYVAC的比较性研究报道，在允许细胞BHK-21中，MVA和NYVAC的滴度与野生型痘苗病毒WR株（Western Reserve strain）基本持平，而在非允许细胞HeLa细胞中，前二者的滴度未升高而WR的滴度升高1万倍。该研究还发现，无论在允许细胞BHK-21还是在非允许细胞HeLa（人源）、BSC-40（猴源）和3T3（鼠源）细胞中，NYVAC都比MVA形成的细胞病变更严重。有趣的是，在感染BHK-21后，NYVAC的细胞结合型病毒滴度低于MVA和WR，鉴于仅NYVAC感染的细胞在晚期有凋亡迹象，提示我们该降低可能是NYVAC引起的严重细胞破坏的结果[13]。

3种病毒的细胞嗜性总结如表1。可以看出，它们在CEF和幼地鼠肾细胞BHK-21中能够有效复制，在人源细胞中均不能有效复制。

3 病毒复制和形态发生

不同于其他DNA病毒，痘病毒在靶细胞的胞浆中复制。病毒基因表达受一种级联机制严格调控，一般病毒感染后早期基因立即利用感染的毒粒中的酶和转录因子开始转录，而中期和晚期基因在病毒DNA复制后才开始转录[12,15-16]。病毒粒子的组装是一个很复杂的过程，涉及几种病毒形态：在病毒进入之后，早期基因转录导致许多与宿主细胞相互作用的分子和病毒DNA合成的分子表达，该过程发生于被粗面内质网包围的核旁工厂区，或者叫复制中心；中期和晚期基因，包括结构蛋白、酶和早期转录因子随后被转录。病毒DNA被包入未成熟病毒粒子（im⁃mature virion，IV），它随后成熟为感染性的胞内成熟病毒粒子（intracellular mature virion，MV），后者代表病毒生命周期中成熟的第一种感染性颗粒；一些MV被高尔基体的双层膜包裹形成胞内包膜病毒粒子（intracellular enveloped virion，WV）；在细胞表面，WV与宿主细胞膜融合，失去外层膜，形成细胞结合型包膜病毒粒子（cell-associated enveloped vi⁃rion，CEV）；CEV直接与细胞膜分离或通过诱导肌动蛋白多聚化而从含有肌动蛋白的微绒毛末梢脱离，最终形成胞外包膜病毒粒子（extracellular envel⁃oped virion，EV）[17]。虽然已了解 MVA、NYVAC 和NTV都失去了在人细胞和大多数哺乳动物细胞中复制和形成感染性病毒粒子的能力，但在三者中造成这种结果的具体机制各不相同。

含有C7L而K1L缺失的MVA的复制缺陷可能是由于病毒粒子包装的阻断。研究表明，MVA在HeLa细胞中的生活周期在感染后晚期被阻断，此时由于病毒粒子包装的阻断仅有4%的MV形成，但早期和晚期病毒蛋白可以产生如同在允许细胞中一样产生[18-20]。至于其机制，报告称在人和鼠细胞中病毒宿主范围因子C7或K1对MVA晚期基因的表达是必不可少的[7]。具体来说，痘苗病毒感染可以引起真核翻译起始因子2α（eIF2α）的磷酸化，从而抑制细胞和病毒蛋白合成，而痘苗病毒已进化出对抗这种抗病毒反应的能力。该研究揭示，在MVA感染的几种人和鼠细胞系中，宿主范围基因K1L和C7L均能抑制eIF2α的磷酸化，而C7L删除的MVA（MVA-ΔC7L）缺乏晚期基因的表达，且这一现象可被宿主范围因子K1或C7的功能拯救。

表1 MVA、NYVAC和NTV的对几种细胞的嗜性

C7L和K1L均缺失的NYVAC的复制缺陷可能是由于晚期病毒蛋白合成的抑制。一项关于MVA和NYVAC在非允许和允许培养细胞中同等条件下的对比研究显示，以5 PFU/细胞的MVA或NYVAC感染HeLa细胞16 h后的电镜照片上，NYVAC感染的细胞胞浆中IV的数量明显少于MVA感染的细胞，说明NYVAC形态发生的阻断同时或先于IV的形成，即在NYVAC感染的细胞中存在翻译阻断[6]。其机制是翻译起始因子eIF2α磷酸化水平的升高影响了某些病毒粒子成熟需要的晚期病毒蛋白的合成，也可能与NYVAC在感染的HeLa细胞中引发的强有力的凋亡有关。

此外，关于MVA和NYVAC的基因表达谱的比较性研究通过对超过15 000个人类基因进行cDNA微阵列扫描发现，在MVA和NYVAC感染的HeLa细胞中，宿主基因的表达有差异[21-22]，可能也会影响病毒成熟的程度。

初步研究表明NTV在具有复制缺陷特点的同时，保留了与原天坛株痘苗病毒相近的DNA复制、RNA转录和蛋白表达能力[5]。具体来说，痘苗病毒P11晚期启动子下的乙肝病毒SS1基因的表达水平在NTV重组病毒（VHFIL2ΔCKSS1）和原复制型天坛株重组病毒（VHFIL2SS1）之间均无明显差别。至于NTV具体在生活周期的哪一步受阻，尚未见相关报道。非常有趣的是，NTV中C7L和K1L基因均缺失，却能完成P11晚期启动子下的外源基因表达，似乎与上述MVA的研究结果不一致。

4 病毒在组织中的分布

观察病毒是否可以在特异性的组织或器官中复制和扩散，可以反映病毒的组织或器官嗜性，进而决定病毒是否能在特定种属中传播并产生致病性。影响病毒组织嗜性的因素包括影响细胞嗜性的因子（如宿主范围基因）和组织特异性的抗病毒免疫反应，这些因素共同决定病毒在特定组织或器官中的扩散能力和分布[12]。与具有完全复制能力的痘苗病毒WR株相比，MVA、NYVAC和NTV减毒株不能在大多数哺乳动物细胞中产生子代病毒，因此，明确这些病毒在体内的分布和病毒编码基因在不同组织中表达的动力学特点非常重要。

痘病毒，特别是痘苗病毒，可通过几种方式在宿主中传播，即通过肌动蛋白直接在细胞间传播、作为自由的病毒传播、感染白细胞和/或通过病毒诱导的细胞运动传播。其中，MV和EV是2种最主要的感染病毒形式，MV在数量上占绝对优势（＞EV100倍），对病毒在细胞内的增殖起重要作用，但MV形式仅在晚期细胞死亡和包膜破裂后才能传播到远处，而EV则介导病毒的细胞间扩散和远程感染，因而对病毒体内的感染和增殖起重要作用。WV和CEV是介于MV和EV之间的另2种中间形式的病毒，它们对EV的形成至关重要。此外，CEV可以通过细胞和细胞的接触而直接感染临近细胞，因而对病毒在接触细胞中的扩散起重要作用[13,23-26]。

一项关于MVA和NYVAC的体内比较性研究通过生物发光成像法和生化分析测定重组病毒表达的萤光素酶基因[27]。该研究表明，与WR相比，MVA和NYVAC感染细胞中荧光信号的表达都很短暂，表明它们在体内受限复制的特性；二者在腹膜内接种后都能到达并感染接种部位以外的靶组织；2种载体表达的异种抗原在NYVAC感染后比MVA感染后在小鼠体内持续时间长；但是，在感染后短期内MVA比NYVAC的基因表达效率高，推测这种差异并不是由于病毒吸附，而是由病毒进入后发生的时间造成。另一项最近的恒河猴实验表明，雾化和放射标记的表达HIV和HPV抗原的重组MVA和NYVAC抗原产生至少长达6个月的安全和成功的针对外源抗原的免疫应答。另外，对恒河猴模型的闪烁扫描成像结果显示，病毒可被肺和呼吸道的黏膜组织吸收，却不会感染脑和眼。这些研究提示，全身和黏膜途径是MVA和NYVAC安全高效的免疫接种途径[28]。

一项最新的小鼠活体成像法研究NTV的组织分布发现，肌肉和皮内途径感染的NTV-Fluc均局限分布于感染部位，未出现扩散转移现象[29]。

5 病毒-宿主细胞间的相互作用

尽管MVA、NYVAC和NTV载体有能够产生与具有完全复制能力的痘苗病毒相同水平的重组抗原以及通过全身和黏膜途径诱发对抗多种感染性疾病的有效的特异性免疫反应的能力[3,5,30-36]，仅有少数研究在相同条件下对比了基于这些毒株的重组体引发的免疫反应。

研究表明，表达HIV-1抗原的MVA和NYVAC可诱发强有力的针对外源抗原的细胞免疫反应，但这种反应的广度和宽度因痘病毒载体不同而异，还受方法和所用动物模型的影响[37-38]。在NTV、MVA和NYVAC减毒株的产生过程中，一些免疫调节基因被删除或被破坏，这或许能够解释为何三者的复制虽然受到限制，但却保留了较好的免疫原性。MVA比NYVAC丢失了更多的免疫调节基因，这与二者在体内诱导出炎症反应的时机和强度一致。比如，MVA比NYVAC传播和诱导抗病毒反应要快，但也被快速清除（48 h后），然而NYVAC载体可诱发延迟的抗病毒反应，且在感染动物组织中保持的时间比MVA长24 h[27]。另一项更深入的MVA和NYVAC载体的比较研究表明，MVA载体在诱导CD4+T细胞反应的同时，更倾向于诱导特异性CD8+T细胞反应，而NYVAC载体比MVA更能促进CD4+T细胞反应[39]。这些发现强调了MVA和NYVAC引发的细胞反应的差异，而这些差异可能会影响疫苗的效力。MVA和NYVAC之间的另一个显著区别是感染不成熟的人单核细胞来源的树突细胞（mDC）后调节宿主免疫反应的能力[40]。与未感染的mDC相比，这些载体对于宿主基因的表达有很大的影响：二者都能上调195个相同的基因，同时MVA还上调另外359个基因，而NYVAC上调另外165个基因。在mRNA水平，虽然二者都上调IL-12、IFN-β和TNF-α，但它们被MVA上调的水平更高，且MVA感染会选择性地诱导Ⅰ型干扰素、IL-6和Toll样受体通路。值得注意的是，在NYVAC感染的mDC中，CD8+T细胞刺激基因显著降低。另外，NYVAC在体内更长期的基因表达可能会影响载体诱导CD4+T细胞反应的倾向，因为有报道说，推动这个T细胞亚群的克隆扩增和分化需要在整个细胞扩增期都有抗原持续存在[41]。

关于NTV的相关研究不多。有报道说，NTV疫苗免疫小鼠后能检测到高水平的IFN-γ分泌，并能引起小鼠外周血中性粒细胞数、淋巴细胞数和白细胞总数增加，脾脏重量增加，还能引起注射部位肌肉、骨神经及肌肉的炎性细胞浸润和纤维组织增生及腹股沟淋巴结生发中心易染体巨噬细胞增多[42]。

6 结语

以上介绍了NTV、MVA和NYVAC的几个主要生物学性状。不难发现，目前关于非复制型痘苗病毒MVA和NYVAC的生物学性状的比较性研究较为深入，而关于我国NTV的生物学性状的研究较少，然而对这些病毒生物学性状的探讨对于今后基于这些病毒的重组疫苗的开发有重要意义。比如，研究NYVAC的体外生长特性发现，NYVAC感染后的细胞在晚期有凋亡的迹象，可能对病毒的复制和形态发生有重要影响，及它会影响NYVAC晚期蛋白翻译和随后IV的形成。换言之，影响作为抗原的病毒晚期蛋白的表达，同时影响宿主细胞MHC分子的表达，进而影响抗原呈递效率，这可能对基于NYVAC的重组疫苗特别是肿瘤疫苗诱发有效的免疫反应十分不利。另一个例子，研究MVA、NYVAC和NTV感染细胞的细胞病变效应时发现，这些病毒产生的细胞病变效应明显弱于具有完全复制能力的毒株，从安全性的角度讲这是有利的，但在肿瘤治疗性疫苗的研究中，病毒感染后破坏宿主细胞会促进肿瘤抗原的释放，因此，可能需要研究如何克服肿瘤抗原释放问题的方法。第三个例子是通过研究以不同途径接种的MVA和NYVAC在组织中的分布情况，可以找到安全有效的接种途径，事实上，还能进一步对动物模型中的给药剂量、诱发的免疫反应类型和持续时间进行探索。第四个例子是发现MVA倾向于促进CD8+T细胞反应，我们就可以根据不同类型疫苗（比如预防性疫苗和治疗性疫苗）研发的需要选择合适的载体。

关于NTV的生物学性状在很多方面还有大量的工作可以做，比如NTV的体外生长特性的研究，NTV的复制和形态发生的研究（包括NTV的晚期病毒蛋白表达机制以及与C7L和K1L的关系，NTV具体在生活周期的哪一步被阻断），通过人工选择突变研究NTV的生物学性状与可能对应的功能基因的关系，NTV与其他非复制型痘苗病毒在组织中分布的比较，以及NTV和宿主细胞的相互作用诱发的免疫反应和机理的研究等。正如前言中所说，以非复制型痘苗病毒为载体的重组疫苗在反恐和肿瘤治疗等领域具有广阔的应用前景，我们相信，对NTV生物学性状的深入研究必定会促进基于NTV的针对多种感染性疾病和多种肿瘤的重组疫苗研发。

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