偏肿革裥菌獿g瞞np1基因克隆及表达研究

闫洪波等

摘要 [目的]研究偏肿革裥菌Lgmnp1基因的克隆及表达情况。[方法]根据白腐菌锰过氧化物酶（MnP）基因保守序列设计引物，采用PCR、RACE及染色体步移等方法，克隆偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因（GenBank登录号JQ327834 ），进行蛋白序列分析，并通过双酶切的方法获得重组质粒，将该重组质粒电转化至巴斯德毕赤酵母中进行异源表达。[结果]获得偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因，命名为Lgmnp1。蛋白序列分析表明LgMnP1含有4个二硫键属于短MnP，预测成熟蛋白分子量为35.94 kD，pI为4.43。通过双酶切的方法将Lgmnp1的开放阅读框（ORF）序列连接到pPICZB载体上，获得重组质粒pPICZB/Lgmnp1，转化子经PCR验证后，在BMMY培养基中甲醇诱导培养，在未添加血红素的培养液中MnP胞外酶活在72 h达到最高为7 U/L，表明Lgmnp1已被转化至毕赤酵母中并可诱导表达。[结论]该方法对偏肿革裥菌Lgmnp1基因的克隆及表达情况进行研究，为偏肿革裥菌Lgmnp1基因的进一步应用提供了依据。

关键词 偏肿革裥菌；锰过氧化物酶；基因克隆；毕赤酵母；基因表达

中图分类号 S718.81 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03186-05

Abstract [Objective] To study cloning and expression of Lgmnp1 gene from Lenzites gibbosa. [Method] A full length DNA gene Lgmnp1 encoding for an isoenzyme of manganese peroxidase （MnP） from Lenzites gibbosa stain CB1 （GenBank accession No. JQ327834） was cloned by the methods of PCR， RACE， and Genome Walking PCR with primers designed based on the conserved sequences of the known MnP genes from other whiterot fungi and amplified DNA fragments. [Result] Protein sequence analysis showed that LgMnP1 belonged to short MnP due to its 4 disulfide bonds. The predicted molecular mass of mature LgMnP1 was 35.94 kDa， and the pI was 4.43. The full open reading frame（ORF） sequence of Lgmnp1 was cloned by restriction enzyme digestion primers. The recombinant plasmid pPICZB/Lgmnp1 was constructed by ligating the ORF sequence and the expression plasmid pPICZB both digested by the restriction enzyme EcoRI and XbaI. Then the pPICZB/Lgmnp1 was transformed into P. pastoris by electroporation. After verified by PCR， two transformant Pichia strains were cultured in BMMY medium and induced by anhydrous methanol added at each 24 h， and their MnP activities were determined during 96 h. Results showed that the transformant strain 1 could produce MnP activity in the absence of heme， and the highest MnP activity in the culture supernatant was 7 U/L after 72 h incubation， indicating that the gene Lgmnp1 had been effectively transformed into the recombinant Pichia pastoris SMD1168HLgmnp1 and expressed in inductive environment. [Conclusion] The cloning and expression of Lgmnp1 gene from Lenzites gibbosa was studied， which will provide a reference for further application of Lgmnp1 gene.

Key words Lenzites gibbosa； Manganese peroxidase（MnP）； Gene cloning； Pichia pastoris； Gene expression

木质素是苯丙烷类结构单元之间以醚键和碳碳键相连接的一类复杂的天然芳香族高聚物，与其他生物高分子如纤维素等明显不同，不含易水解的重复单元，因而不受水解酶的控制，其生物降解机制是氧化作用；其分子结构复杂且含有较多的在生物学上稳定的键型，性状稳定，难以为一般的微生物所分解。能够引起木质素强烈分解的只有木材白腐菌（White rot fungi），而木材褐腐菌、细菌及放线菌一般只能部分地改变木质素分子的结构，或将已被白腐菌降解到一定程度的木质素及其断裂的芳香化合物进一步加以分解。由于白腐菌能够有效地降解木质素，及废水和土壤中难被降解的多氯联苯、多环芳烃、DDT、染料、炸药及叠氮化合物等有毒物质。因此，研究白腐菌的酶学及其基因学具有重要的应用意义。白腐菌产生的木质素降解酶主要包括锰过氧化物酶（Manganese Peroxidase，MnP）、木质素过氧化物酶（Lignin Peroxidase，LiP）和漆酶（laccase）等。一些白腐菌产生上述这3种分解木质素的酶，而大多数白腐菌仅产生2种甚至1种分解木质素的酶，表明这3种酶在分解木质素的过程中并不是全都必需的。MnPs（EC 1.11.1.13）是一种依赖H2O2的含Fe3+和血红素辅基的糖基化细胞外过氧化物酶，广泛存在于白腐菌中，到目前为止在其他微生物中并未发现有MnP的相关报道。MnP可氧化木质素中的酚类和非酚类的结构单元。

基因克隆与表达是目前国内外对于基因研究的一个主要技术手段[1]。国外目前已经被克隆的MnP同工酶基因主要有：黄包原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的mnp1、mnp2、mnp3和mnp4[2]，虫拟蜡菌（Ceriporiopsis subvermispora）的mnp1、mnp2A、mnp2B、mnp3和mnp4[3]，云芝（Trametes versicolor）的mnp1和mnp2[4]，射脉菌（Phlebia radiata）的mnp1、mnp2和mnp3[5]，香菇（Lentinula edodes）的mnp1[6]，地中海拟层孔菌（Fomitiporia mediterranea）的mnp1、mnp2和mnp3[7]等。但国内对MnP同工酶基因的研究还较少。偏肿革裥菌（Lenzites gibbosa）是一种对木材和木质素分解能力较强的白腐菌，对该种MnP基因的研究国内外尚属空白。笔者在完成该菌株一个编码MnP蛋白基因Lgmnp1克隆的基础上，将该mnp基因转化到了毕赤酵母中实现了异源表达，以期为以后该类基因的功能研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168H及酵母表达载体质粒pPICZB，购自Invitrogen公司；偏肿革裥菌L.gibbosa菌株CB1，自长白山采集并分离，菌种保藏于东北林业大学森林病虫病理实验室。YPD平板培养基：1%（W/V）酵母粉；2%（W/V）蛋白胨；2%（W/V）葡萄糖；2%（W/V）琼脂粉；100 μg/ml Zeocin。产酶基础培养基为低氮天冬酰胺-琥珀酸培养基（LNAS，Low Nitrogen Asparagine Succinic acid）[8]。BMGY/BMMY培养基：1%（W/V）酵母粉；2%（W/V）蛋白陈：100 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 6.0）；1.34% YNB；4×10-5%生物素；1%甘油/1%甲醇。

1.2 Lgmnp1 基因克隆

1.2.1 Lgmnp1 基因DNA片段的扩增。离心收集生长在2.000 g青杨（Populus ussuriensis）木屑为产酶底物的LNAS培养液内9～13 d的菌丝[9]，液氮冻存备用。使用TIANGEN公司的DNAquick快捷型植物基因组DNA试剂盒提取所收集菌丝的基因组DNA。 根据白腐菌MnP基因序列保守区设计引物1F、1R（表1），以L.gibbosa基因组DNA为模板，扩增Lgmnp基因的DNA片段。1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。具有目的条带的PCR扩增产物测序后进行BLAST比对，确认与MnP同源后，根据该序列外显子部分设计RACE引物。

1.2.2 Lgmnp1全长DNA基因的扩增。用OMEGA公司的E.Z.N.A.TM总RNA提取试剂盒及相关方法提取总RNA。根据“1.2.1”中获得的DNA序列外显子部分设计了一条5′RACE引物（表1），使用Clontech 的SMART RACE cDNA扩增试剂盒进行5′RACE反应，反应体系及条件详见试剂盒说明书。根据5′ RACE获得的cDNA片段，设计一对特异性基因组上下游引物DNAup和DNAdown，以L.gibbosa基因组DNA为模板，扩增该引物对范围内的DNA序列。根据该DNA序列设计5′和3′端walking PCR 引物，其5′上游序列的扩增见[10]，两轮3′端引物见表1，用TaKaRa公司的染色体步移试剂盒（Genome Walking Kit）及相关方法进行基因组序列扩增。引物设计要求、PCR的反应体系、扩增的温度条件和循环数等见（http：//www.takara.com.cn/？action=Page&Plat=pdetail&newsid=289&subclass=1）。扩增完毕后，取第2、3轮PCR反应液各2 μl，用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，观察电泳图确定目的条带。对获得的序列进行比对、拼接，获得全长DNA基因。通过NCBI的ORF Finder （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov /projects/gorf/）查找该基因的读码框ORF，分析起始密码子，终止密码子，以及5′ 非翻译区和3′ 非翻译区等信息。使用BioEdit分析软件对 cDNA核苷酸序列进行碱基成分分析，将cDNA核苷酸序列翻译为氨基酸序列，并对其氨基酸组成进行分析。使用NCBI的BLAST和Conserved Domain Database（CDD）软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析蛋白序列的基本信息、保守结构域。采用Signal Scan（http：//wwwbimas.cit.nih.gov/molbio/signal/）和SignalP 4.0（ http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）预测蛋白信号肽。

1.3 Lgmnp1在毕赤酵母中的表达

1.3.1 重组质粒的构建与验证。以“1.2.2”中5′RACE中RTPCR获得的cDNA第一链为模板，用上游引物BDF：5′CGGAATTCATGGCGTTCAAGCTACTC 3′，下划线为EcoRI酶切位点；和下游引物BDR：5′GCTCTAGATTAGGACGGGGGGACGGG 3′，下划线为XbaI酶切位点，PCR扩增Lgmnp1完整编码序列（coding sequence，CDS）。将Lgmnp1完整CDS与表达载体质粒pPICZB分别用EcoRI和XbaI双酶切，然后用T4连接酶进行连接，构建重组质粒pPICZB/Lgmnp1。将连接产物转化到大肠杆菌Top10中，蓝白斑筛选阳性克隆，用质粒提取试剂盒提取质粒，用双酶切引物BDF和BDF进行PCR验证，及用EcoRI和XbaI进行双酶切验证。对验证正确的重组质粒用AOX通用引物进行测序和碱基突变分析。

1.3.2 重组质粒转化毕赤酵母及转化子的MnP活性检测。对含重组质粒的Top10阳性克隆提取质粒DNA，通过BamH I单酶切将其线性化，电转化到巴斯德毕赤酵母P.pastoris 的感受态细胞中。用含有Zeocin的YAD平板进行筛选，获得的转化子用AOX通用引物及引物BDF和BDR进行PCR验证。将PCR验证正确的转化子菌株接种到BMGY培养基中，振荡培养（30 ℃，280 r/min）至OD600在2～6，离心收集菌体，重悬于BMMY培养基中至OD600=1，每24 h加入无水甲醇至终浓度0.5%。由于血红素是MnP在酵母中表达的限制性因素，因此设置2组试验，分别为不添加和添加血红素，添加血红素的终浓度为500 mg/L[10]。在0～96 h内每隔12 h提取菌液进行酵母生长量（以OD600作为酵母的相对生长量）和MnP活性检测，酶活检测方法同[8]。

2 结果与分析

2.1 Lgmnp1全长基因的克隆结果 首先，以L.gibbosa DNA为模板，用引物1F和1R扩增到一个400 bp目的基因片段。将该序列进行BLAST比对，发现其与T.versicolor的MnP序列具有较高同源性，为83%，因此确定该序列为L.gibbosa的MnP基因片段。其次，通过5′ RACE PCR扩增得到约500 bp目的条带，测序结果显示该序列中包含5′ RACE接头引物和特异性引物5′ race GSP。BLAST比对结果表明，该5′ RACE片段与T.versicolor的MnP序列同源性可达82%。但该序列与最初获得的MnP基因400 bp片段序列差异较大，无法拼接。这一结果是由于白腐真菌中存在MnP基因家族，且不同的MnP基因之间存在较高的相似性。于是，试验将该5′ RACE片段命名为Lgmnp1。根据基因组特异性上下游引物DNAup和DNAdown获得415 bp DNA片段，序列比对表明该片段与5′ RACE获得的基因片段具有重叠区域，为Lgmnp1的DNA序列。5′上游walking PCR的结果见[10]。为了获得该Lgmnp1基因的3′端序列，试验继续利用walking PCR方法。第1轮PCR扩增获得3′端1 014 bp的序列，该序列与415 bp DNA片段有334 bp重叠区域，第2轮3′端PCR扩增得到2 292 bp目的DNA序列，该序列与walking PCR第1轮序列有318 bp的重叠区域，这一结果表明所得序列即为Lgmnp1下游3′端序列。通过序列拼接得到完整的Lgmnp1 DNA序列，GenBank登录号为JQ327834。并比对出完整的cDNA基因，登录号分别为FJ848739。

序列结构分析的结果表明，基因Lgmnp1的DNA全长4 595 bp，含有6个外显子和5个内含子，外显子长13～340 bp，内含子长56～68 bp；其cDNA基因含有49 bp的5′UTR及129 bp的3′UTR序列，编码区长度为1 095 bp。从ATG到TAA的cDNA序列GC含量占65%，而DNA序列由于加入了内含子导致了GC含量下降了3.2%。在cDNA水平上Lgmnp1与T.versicolor的mnp、mnp2、cmp5和cmp3基因（GenBank登录号分别为AJ745879、AF102515、AY677131、AY677130）覆盖率为100%，其相似性最高为82%～83%。

2.2 推定的偏肿革裥菌锰过氧化物酶1（LgMnP1）的特征 LgMnp1基因编码364个氨基酸（amino acid，aa）的蛋白质多肽前体（GenBank登录号：ACO92620），包含了一个21aa的信号肽及5aa的前导短肽。LgMnP1成熟蛋白长度为338 aa，预测成熟蛋白分子量为35.94 kD，pI为4.43，带负电荷残基（Asp+Glu）有43个，带正电荷残基（Arg+Lys+His）有30个，总原子数为4 979个，分子式为C1588H2447N433O501S10。其催化结构、晶体结构和功能有关的氨基酸残基与其他白腐菌的MnP类似，都具有保守性。主要包括：①3个与血红素连接的氨基酸R43、H47和H176。②3个与Mn2+连接的氨基酸E36、E40和D182。③5个与血红素近侧末端的Ca2+连接的氨基酸 T177、D194、T196、E198和D201，4个与远侧末端的Ca2+连接的氨基酸D48、G66、D68和S70。④构成4个二硫桥的8个半胱氨酸残基C3∶C15、C14∶C285、C34∶C120和C249∶C314。氨基酸序列比对结果表明，Lgmnp1与T.versicolor的MnP（CAG33918）同源性最高为88%，与Polyporus brumalis的MnP3蛋白（AEJ37996）同源性为86%。Lgmnp1由于含有4个二硫键，可将其归入短MnPs类群。

2.3 Lgmnp1基因的完整CDS扩增 PCR扩增获得约1.1 kb的特异性目的条带，见图1A。凝胶回收该片段，加A尾处理后与T克隆载体连接，转化大肠杆菌后，筛选出5个阳性转化子，分别提取质粒进行PCR验证，结果有3个转化子PCR验证正确，见图1B中的3、5、7泳道。将这3个单克隆的培养菌液进行测序，与Lgmnp1的ORF序列进行比对，结果序列比对结果完全一致，未发生碱基突变。

2.4 重组质粒pPICZB/Lgmnp1的验证 通过引物BDF和BDR对重组质粒pPICZB/Lg mnp1进行PCR验证，结果显示在1.1 kb处产生清晰特异性条带，与CDS序列大小一致，见图1C；用EcoRI和XbaI双酶切后在1.1和3.3 kb处产生2条清晰特异性条带，1.1 kb处为目的CDS条带，3.3 kb处为pPICZB载体条带，见图1D。对重组质粒用AOX通用引物测序，结果发现该序列未有碱基发生突变。以上结果说明Lgmnp1的完整CDS序列已经连入pPICZB载体中，重组质粒pPICZB/Lgmnp1构建成功。

2.5 毕赤酵母转化子的PCR验证 将转化后在筛选平板上生长的酵母菌株分别命名为1、2和3号菌株，用AOX通用引物和引物BDF和BDR进行PCR验证，结果如图1E。其中2～4泳道为引物BDF和BDR的PCR扩增结果，5～7泳道为AOX通用引物PCR扩增结果。引物BDF和BDR的PCR扩增结果中仅第2泳道的1号菌株在1.1 kb处有一条较为模糊的目的条带；AOX通用引物PCR扩增的第5、7泳道的1和3号菌株各自显示2条带，其中1.3 kb条带为目的基因与约200 bp的pPICZB载体序列，2.1 kb条带为AOX1基因条带。该结果表明pPICZB/Lgmnp1重组质粒已被整合到毕赤酵母菌株中。因此，继续用1和3号菌株进行MnP的诱导表达。

2.6 毕赤酵母转化子生长量的测定和重组MnP的诱导表达 毕赤酵母在MM培养基中的生长量通过测定600 nm处的吸光度值OD600来确定。如图2A所示，重组酵母菌株的生物量随着时间的增长不断增加，菌株1和3的生长速度几乎相同，但添加血红素处理菌株明显比未处理菌株生长要慢，如图2B所示。3号菌株在培养过程中无论是否添加血红素都未检测到MnP酶活；而菌株1在未加入血红素的培养基中，在48 h出现MnP的酶活性，72 h达到最大酶活力为7 U/L，96 h几乎下降为0，说明Lgmnp1已经有效地被转化到了毕赤酵母菌株中，并在甲醇诱导下得到表达。但该菌株在添加了血红素的培养基中反而未检测到MnP的活性变化。

3 结论与讨论

为了有效地探讨白腐菌锰过氧化物酶MnP基因的表达调控机理，有必要进行该基因的转化与表达研究。编码白腐菌木质素降解酶系统的基因已经在几种宿主细胞中得到表达，主要有大肠杆菌（Escherichia coli）、巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）[9]及构巢曲霉（Aspergillus nidulans）等丝状真菌。目前已商业化的基因工程产品大多是通过（E.coli）表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但由于其是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理才能应用。如MnP基因在E.coli中的表达产物既为无血红素插入的、无酶活性的包涵体。近年来以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益受到重视和利用，原因是酵母是一种单细胞真核生物，其不仅具有易培养、繁殖快、遗传操作简单等优势，还具有真核生物表达时对蛋白质进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能，有利于真核基因的表达。P.pastoris是甲基营养型酵母，是经过改进的第2代整合型表达系统，其表达载体包含乙醇氧化酶1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5′AOX1和3′AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。当整合型载体转化受体酵母时，其5′AOX1和3′AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到酵母染色体上，形成稳定遗传的细胞系，外源基因在5′AOX1启动子控制下表达。P.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统。试验首先采用PCR、RACE及染色体步移等方法，克隆了偏肿革裥菌L.gibbosa菌株CB1的MnP1全长基因Lgmnp1和完整CDS基因，在对该基因与蛋白序列进行了基本生物信息学分析的基础上，将其CDS基因整合到重组质粒pPICZB/Lgmnp1并转化到了P.pastoris的基因组中，使该基因在甲醇诱导下实现了异源表达。

由于白腐菌分泌的MnPs在自然状态下是高度螺旋的含血红素的五聚物糖蛋白，所以MnPs蛋白翻译后血红素的加入是修饰的必有环节。关于MnP在P.pastoris中异源表达的报道，例如黄孢原毛平革菌（P.chrysosporium）的mnp2基因在P.pastoris中得到成功表达，提及到血红素对其活性的影响很大[9]，P.chrysosporium的MnP1基因也已经在A.oryzae中实现了表达，但血红素仍为MnP酶活的限制性因素[11]。在这些文献中提及了血红素的终浓度为500 mg/L，配制方法使用0.1～1.0 mol/L的NaOH溶液，因此试验也尝试用血红素来提高重组MnP的表达活性，选择了用0.1 mol/L NaOH配置血红素溶液，所用浓度为500 mg/L，但却未能够检测到MnP的活性。分析原因一种可能是由于血红素只溶于弱碱性环境，添加碱性的血红素溶液后酵母生长环境的pH值发生了变化，改变了酵母的最适生长环境，这对酵母的生长具有一定的抑制作用，而这可能也阻碍了酵母转化子对MnP的分泌和表达。添加血红素后生物量的确下降了，这点从图2A中可观察到。第2种可能是由于血红素的浓度过高，500 mg/L不是适宜的浓度，今后还需要通过梯度筛选对血红素的用量进一步摸索，同时对添加方式、时间等条件进一步测试。

试验获得重组MnP的酶活较低，虽然酵母转化子比本体菌株表现出MnP的活性时间提前了2～3 d，这一结果与相关报道类似[9]。因此无法进行蛋白纯化及相关的酶学分析等后续试验。重组酵母MnP的表达活性低还可能与重组酶信号肽的选择有关，毕赤酵母胞外表达外源蛋白时信号肽的选择是影响外源蛋白表达量的一个重要因素，信号肽在引导蛋白分泌到胞外的过程中发挥着重要作用，不同的信号肽可导致目的蛋白分泌量的不同，可进一步尝试选用酿酒酵母的a因子前导肽（aMF）作为MnP基因在毕赤酵母中实现表达的信号肽。外源基因在酵母中的表达活性低还与酵母的培养条件及酵母培养过程中外源表达蛋白产生的诱导条件有关，还需对重组酵母的培养条件和产生MnP的诱导条件进行优化。

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