玉米EMS突变体库构建及突变体初步鉴定

樊双虎 郭文柱 路小铎等

摘要 [目的]构建玉米诱变变体库，创制玉米新种质资源。[方法]采用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变玉米优良自交系B73和郑58，构建变体库；选取小叶夹角突变体rla1、rla2进行密植产量测定和遗传学分析。[结果]2个突变体库的M2代含有表型丰富的突变体，尤其是一些突变体表现出优良农艺性状，如叶夹角小、棕色叶中脉、矮化、抗性，具有重要的育种价值。rla1、rla2表型相似，较初始材料耐密植，在试验各种植密度下，单位面积产量均高于对照组；且产量随着密度增大而提高，其最大密植度在100 000株/hm2。遗传学分析显示，rla1、rla2都是单基因隐性突变，而且是等位基因突变。[结论]B73和郑58的EMS突变体库为玉米育种提供了宝贵的材料资源。

关键词 甲基磺酸乙酯；突变体库；种质资源；叶夹角

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03162-04

Abstract [Objective] The aim was to construct mutant libraries of maize and create new maize germplasm resources. [Method] Mutant libraries of maize inbred B73 and Zheng 58 were constructed by EMS mutagenesis. Measurement the yield under high density and genetic analysis of rla1 and rla2 was carried out. [Result] The M2 generation contained various phenotypes of mutants. Above all， some mutants showed excellent agronomic traits， such as small leaf angle， brown leaf midrib， dwarfism and resistance， which were very valuable in maize breeding. The narrow leaf angle mutants rla1 and rla2 had similar phenotype， and allowed higher planting densities than the wild type line. Under different planting densities in this study， the yields of rla1 and rla2 per unit area were higher than control， and increased as the increase of planting density， whose proper maximum density would be more than 100 000 plants per hectare. The results of genetics analysis indicated that the mutant phenotype of rla1 and rla2 was caused by recessive mutation in a single locus， and rla1 and rla2 were two alleles of the same gene. [Conclusion] The EMS mutant libraries of B73 and Zheng 58 provided valuable germplasm resources for maize breeding.

Key words Ethyl methane sulfonate； Mutant library； Germplasm resource； Leaf angle

玉米是食用和能源两用作物，是目前世界上应用价值最高的作物之一，自2012年已成为我国第一大粮食作物。培育优良品种，提高玉米产量，对满足我国粮食、食品、能源需求具有重要意义。当前我国玉米生产和育种所依赖的种质基础仅局限于3～4个种群中的数个骨干自交系，生产用种质的遗传脆弱性和创新能力不足成为选育突破性新品种的瓶颈。玉米种质资源的创新，对拓宽我国玉米种质的遗传基础具有重要理论价值和现实意义。传统育种技术选择效率低、周期长，不能满足当前玉米生产对优良品种的需求。化学诱变可以提高突变频率，加快新种质的创制速度。

甲基磺酸乙酯（EMS，ethyl methane sulfonate）是一种高效诱变剂，诱变频率高，突变位点在基因组中分布均匀，对基因组伤害小，优良的突变体材料可以直接用于育种[1-2]。1978年Neuffer用EMS的石蜡油溶液诱变玉米花粉并获得成功，之后Garst Seed Co.用EMS处理玉米自交系花粉获得了抗除草剂突变体[3]，美国ICI公司从玉米EMS诱变群体中先后筛选到抗除草剂Pursuit突变体、糯质突变体和甜质突变体[4]。Allen Wright从EMS诱变的B73 M3后代中分别筛选到高油、高亚油酸、高赖氨酸、高蛋白、高油酸和低棕榈酸突变株。Victor Roboy也从玉米EMS诱变后代中筛出了高油突变体[4]。国内外研究表明，EMS诱变玉米花粉可以产生丰富的种质资源，而且到目前为止EMS诱变是玉米突变体创制最成功的方法。试验用EMS诱变B73和郑58花粉，分别建立B73和郑58的突变体库，在突变体库中筛选表型丰富的突变体，以期为后期的育种实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 试验诱变亲本为玉米自交系B73和郑58，均为实验室培育；诱变剂甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）与载体剂轻质石蜡油，均购自sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 EMS诱变处理[5]。参照Neuffer的方法来配制EMS石蜡油溶液，并诱变B73、郑58花粉。在通风橱内将EMS和石蜡油按1∶100（V/V）配成1%母液，然后用搅拌器搅拌1 h。选择生长良好的植株，在雌穗吐丝前套袋，待花丝长出适当长度即可用于诱变处理。诱变处理前1 d下午用杂交袋套好雄穗，将1% EMS母液用石蜡油稀释至0.067% 的工作液。处理当天上午在露水退去后，收集新鲜花粉，筛子过滤后，将花粉和EMS工作液按1∶10（V/V）混合，在28 ℃摇床上摇5 min，间隔5 min，如此重复，持续45 min；然后用毛笔将石蜡油和花粉的混合液均匀地刷在玉米花丝上，将雌穗套袋并做好标记。B73、郑58各自诱变200株。

1.2.2 EMS突变体库繁育及突变体筛选。EMS突变体库繁育小区行长5 m，行距60 cm，株距25 cm。EMS诱变果穗成熟后得到M1种子，M1种子全部单粒播种。从M1自交所得的每个M2果穗上随机选取20粒种子，单粒播种成1行，即穗行种植，每行为一个M2家系，每15行突变体设有1行野生型对照。在每一个M2家系中，筛选突变体并做表型记录，突变体全部自交（不育的例外），无明显突变表型的自交5株，每个M2家系及突变体都挂牌标记。

1.2.3 密植试验设计。采用裂区试验设计，3种种植密度为主处理，rla1的M4代、rla2的M4代、野生型B73为副处理，重复3次，小区面积为3 m×6 m，统计每个小区的产量，并换算成每公顷的产量。

1.2.4 遗传学分析。rla1、rla2分别与B73野生型回交，观察F1表型，统计F2群体中的野生表型和突变表型的数量。rla1和rla2杂交，观察F1后代表型。

2 结果与分析

2.1 突变体库建立 EMS诱变分别得到B73、郑58的M1种子9 736和9 258粒，全部单粒播种，出苗5 592和5 713株，出苗率分别为57.44%和61.71%。相同栽培条件下分别统计野生型B73、郑58的出苗率分别为92.72%和94.08%。M1种子携带有大量的致死突变，包括无胚突变，印象种子萌发，因此M1种子出苗率大幅度下降[6]。B73、郑58的M1植株自交分别获得4 328和4 657个M2果穗，穗行播种成4 328和4 657行，单株分别有69 265和77 026株。

2.2 突变体表型统计 B73、郑58突变体库的M2代反应了丰富的遗传变异，包括叶色、叶型、分蘖、表皮毛、抗性和株高等性状（表2）。其中，矮化突变率最高，分别达到0.608%和0.458%，而郑58的抗虫和抗旱表型的突变频率仅为0.003%。

2.2.1 叶色突变体。叶色突变体也称为叶绿素突变体[7]，B73的M2代有93株白化苗（图1A），142株黄化苗（图1B），突变率分别为0.134%和0.205%；郑58的M2代中有86株白化苗（图1C）和93株黄化苗（图1D），突变率分别为0.112%和0.121%。这类突变体直接或间接影响叶绿素的合成或降解，绝大部分随着生长时间增长都枯萎死亡。但是某些浅绿色叶片突变体能够正常生长发育（图1E）。

2.2.2 棕色叶中脉突变体。玉米叶中脉一般是浅绿色的，郑58的M2群体有9个的家系18株棕色叶中脉突变体（bm，Brown midrib）（图1F、G），变率为0.023%。除了叶中脉，雄穗和茎秆也呈现棕色（图1H、I）。bm的木质素含量较低[8-9]，可提高青贮玉米的营养价值。 但在B73背景下，没有得到bm的突变体。

2.2.3 叶型突变体。B73和郑58的M2群体里都有叶型突变体，包括叶片变细、叶夹角变小突变类型。B73群体有9个家系13株细叶突变体（图1J），郑58群体有21个家系32株细叶突变体（图1K），突变率分别为0.019%和0.042%。叶夹角突变体极少，B73群体仅有5个家系12株小叶夹角突变体（图1L），郑58群体有3个家系8株小叶夹角突变体（图1M），突变率分别为0.017%和0.010%。

2.2.4 分蘖突变体。玉米的近缘种大刍草分蘖很多，玉米一般没有分蘖，在B73的突变库中发现了3个家系15株分蘖突变体（图2A），突变频率为0.022%。但在郑58背景下没有发现分蘖增加的突变体。

2.2.5 表皮毛增多突变体。表皮毛是植物组织表面一种毛状结构附属物，在B73的突变库中共发现了7个家系23株叶鞘表皮毛增多突变体（图2B），突变频率为0.033%。

2.2.6 抗性突变体。从郑58的M2群体中筛选到抗虫和抗旱突变体各2株（图2C～E），此种突变类型较为少见，突变率都为0.003%。

2.2.7 匍匐茎突变体。在郑58突变群体的13的家系里发现了72株匍匐茎突变体（图2F），突变频率为0.093%。此突变体茎秆匍匐在地，但可以正常开花结实。但在B73背景下没有筛选到匍匐茎的突变体。

2.2.8 矮化突变体。B73和郑58经过EMS诱变后，株高受到很大影响，在突变体库中发现了大量的矮化突变体，也是最多的一类突变体，B73突变群体有285个家系421株矮化突变体（图2G），郑58突变群体有198个家系353株矮化突变体（图2H），突变率分别为0.608%、0.458%。

2.3 小叶夹角突变体表型鉴定及密植测产 小叶夹角是玉米优良的农艺性状，具有密植的潜力。从B73的12株小叶夹角突变体中选出2株（图3A），这2株来自不同的M2家系，将其命名为rla1、rla2。这2个小叶夹角突变体表型相似，穗下叶夹角较开展，角度为15度，穗上叶片几乎紧贴茎干生长，叶片开展角度为5°（图3C），而野生型穗下叶片的开展角度为55°，穗上叶片开展角度为27°（图3B）。进一步观察发现rla1和rla2突变体无叶舌（图3D）。

在每种种植密度下，随机选取并统计B73 、rla1、rla2的果穗各15穗，结果显示，在66 667株/hm2密度下，野生型和突变体果穗大小和重量相差不大（图3E和表3），经方差分析可知野生型和突变体单穗重差异不显著（P>0.05）。随着种植密度增加，野生型和2个突变体单穗重都下降，但是突

变体单穗重下降幅度相对较小；密度为83333株/hm2时，

注：A为B73白化苗；B为B73黄化苗；C为郑58白化苗；D为郑58黄化苗；E为B73浅绿色叶片突变体；F和G为郑58野生型和bm突变体的叶中脉；H为郑58野生型和bm的雄穗；I为郑58野生型和bm的茎秆；J为B73野生型和细叶突变体的叶片；K为郑58野生型和细叶突变体的叶片；L为B73野生型和小叶夹角突变体；M为郑58野生型和小叶夹角突变体。

进一步研究其秸秆中木质素的结构和含量，有望为生物乙醇生产提供优良资源，提高乙醇生产率。郑58的抗虫和抗旱突变体无其他不良性状，不用经过转基因审批，可直接用于抗虫和抗旱玉米育种。矮化玉米抗倒伏，耐密植，群体光能利用效率高，郑58、B73突变体库中矮化突变体最多，可用于矮化育种，培育耐密植型矮化玉米新品种。叶夹角是玉米株型的重要方面，小叶夹角可明显提高玉米的种植密度和群体光合效率，进而增加产量。小叶夹角变突变体rla1、rla2株型紧凑，耐密植，而且密植潜力大于100 000株/hm2，为密植型玉米新品种的培育提供了宝贵的种质资源。

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