人类Ago2蛋白与肿瘤的关系研究

林爱琴 赵跃华

摘要 Argonaute2（Ago2）蛋白是RNA诱导沉默复合体（RNAinduced silencing complex、RISC）的核心元件，不仅在miRNA/siRNA通路中促使靶mRNA降解或抑制其蛋白质翻译，调节miRNAs生物合成和成熟，对生物生长发育、干细胞分化和肿瘤形成等有密切关系。

关键词 Argonaute2；RISC；翻译抑制；肿瘤

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03169-03

Abstract Argonaute2（Ago2） protein， the core of RNAinduced silencing complex（RISC）， complexed with the guide strand of a small interfering RNA（siRNA） or a microRNA（miRNA） and ubiquitously expressed and binded to siRNAs or miRNAs to guide posttrascriptional gene silencing either by destabilization of the mRNA or by translational repression. It has important functions in processes as diverse as embryonic development， cell differentiation and tumor biogenesis.

Key words Argonaute2； RISC； Translational repression； Tumor

Ago蛋白最初是从一种黑腹果蝇S2细胞中分离出来的，后来发现在生物体中广泛分布且结构高度保守，它们都是分子量大约都在100 kD的碱性蛋白[1]，又名为GERP95（Golgi ER Protein 95 ku）即与高尔基体和内质网膜相关的蛋白。多种生物基因组分析表明，不同种群参与Ago编码的基因数量从1～27不等[2]。哺乳动物有8个基因参与编码Ago，这个家族成员在结构上典型特征是Ago的N端含有130氨基酸的PAZ结构域、Mid结构域和在C末端含有300个氨基酸组成的Piwi结构域[3]，这3个结构域对于Ago蛋白的功能发挥着重要作用。虽然Ago家族成员都具有类似的结构，但研究表明只有Ago2才是RISC中功能组分[4]。笔者就人类的Ago2结构与功能进行综述。现报道如下。

1 人类Ago2结构研究

2002年，Martinez等在siRNA 3′端标记生物素，在人Hela细胞抽提物中得到了与siRNA结合蛋白复合物，从中鉴定出了2个相对分子量为100 kD蛋白，即Ago1和Ago2[1]。有8个基因参与编码人类Ago蛋白，其中有4个基因编码Ago亚族的Ago1、Ago3、Ago4和Ago2，Ago1、Ago3、Ago4定位于1号染色体（1p34～35）区带，Ago2定位在8号染色体；另4个基因编码Piwi亚族的HIWI1、HIWI2、HIWI3 和HIWI4蛋白，依次定位于12、11、22和8号染色体。人类Ago2由4个区域组成，N端、PAZ结构域、Mid结构域和Piwi结构域。PAZ结构域是一个由6条链构成的左手β桶，在桶的一端连接有2个螺旋，另一端连接1个αβ组件，在β桶与αβ组件之间形成1个口袋状结构，恰好可以插入RNAs 5′末端突出的2个碱基，这就是siRNA的结合位点。Mid结构域与小RNAs的5′端磷酸结构结合将小RNAs与Ago蛋白锚定（或啮合）。Mid结构域中还含有1个高度保守的motif结构，其与elf4E（eukaryotic translational initiation factor 4E）的7甲基鸟嘌呤（m7G）帽结构相似。正是这个类似m7G帽结构阻止人Ago2与elf4E的结合，从而对靶mRNA的转录起始起到阻遏作用。Piwi结构域是1种属于RNase.Ⅲ家族结构域，均含有螺旋包围的5个片层结构，Piwi与RNase.Ⅲ一样催化切割siRNA与RNA形成的dsRNA中的单链RNA，因而具有核酸内切酶的活性[1]，切割产物具有3′OH和5′磷酸结构，Piwi结构域中的Piwibox区（盒）可以直接与Dicer酶结合[2]。Liu等[5]在293T细胞中证明Ago14都能与siRNA结合，但只有Ago2具有“切割”活性，在小鼠中敲除Ago2基因出现一些异常的发育从而导致胚胎死亡。进一步研究发现人类Ago2“切割”（即核酸内切酶）活性中心由Asp597、Asp669、和His807 3个氨基酸组成，若Ago2的D669位点突变，Ago2功能丧失[6]。

2 Ago2的装配研究

Ago2具有抑制蛋白质翻译和促进miRNA、piRNAs生物合成和成熟的miRNA表达的功能，Ago2是RISC的核心成分，与miRNA与siRNA结合构成RISC通过碱基互补原理与靶miRNA完全或不完全互补结合产生效应的。Ago2的装配过程也就是RISC的形成过程，可分为起始阶段和效应阶段。

2.1 起始阶段 主要是内源性或外源性长链RNA（dsRNA）在Ago2介导下生物合成成熟的miRNA、siRNA或piRNA的过程。首先DNA重复序列编码长链miRNA，由Diosha对细胞核里miRNA前体进行剪切，核膜蛋白主动运输于细胞质中，再被Dicer酶剪切掉茎环部成为成熟的长约18～24核苷酸的双链miRNA。Dicer酶还能对外源性dsRNA分子加工成小的双链siRNA[3]。

2.2 效应阶段 与以往观点不同最新研究认为，目前认为双链RNA（dsRNA）在Ago2介导下结合RISC并生成2条单链（即正义链和反义链）是不依赖ATP的[7]，其中反义链与Ago2的PAZ结构域结合，形成Ago2的核糖核蛋白（RNP）复合体。siRNA与靶mRNA序列之间是完全或接近完全互补的。Ago2介导对转录本剪切在距离单链siRNA5′10nt的位点进行。miRNA与靶mRNA 5′端UTR位点不完全互补产生翻译抑制，其反应关键特征是：miRNA和靶mRNA之间存在序列错配[4]。RISC在形成过程中还需要其他蛋白的参与，如TRBP和PACT。

2.3 Ago2装配过程几个关键问题的探讨 Ago2装配中的dsRNA“不对称”的选择：RISC/ Ago2是如何判定降解dsRNA正义链的？Khvorova等[8]分析了siRNA链两端的热动力学稳定性，发现反义链5′端的热力学稳定性差，因而被保留进入RISC复合体成为向导链，有人将这一现象称为“不对称原理（asymmetry rule）”。

Ago2在RNAs沉默途径中的“脱靶”效应：在RNAs沉默途径中，Ago2因其没有序列特异性，可与各种不同序列小RNAs结合，形成RISC。为确保Ago2与小RNAs精确结合而不是降解这些效应分子，导致“脱靶”效应。这条沉默途径还需要1个特定的结构构成监视系统，这种监视系统可能是小RNAs的5′末端突出的2个碱基恰好插入Ago2的PAZ结构域的口袋状结构[2]。另外，小RNAs与RISC结合诱导靶mRNA降解，需要小RNAs的5′端磷酸化结构与Ago2的Mid结构域锚定[9]。

Ago2在装配中的筛选和修饰作用：人体内Dicer只发现1种，而人的miRNA已报道1 800多种（miRBase），外源性siRNA种类更多。尽管Dicer含有多种功能的结构域，但对众多的siRNA/miRNA结合与切割是否存在筛选，未见报道。人类Ago亚族有4种蛋白即hAgo1～4，目前只发现Ago2具有核酸内切酶活性，Dicer募集哪一种Ago组装RISC，其筛选机制、有报道认为可能与靶mRNA碱基互补精确度及互补链末端结构相关[10]。

miRNA的5′端的2～7个碱基是miRNA识别的关键，siRNA的5′端的磷酸化是siRNA识别关键。Filipowicz[11]认为当miRNA的碱基配对核心区与靶mRNA形成完全互补双链时，这种双链可形成A型螺旋与Ago2的DDH氨基酸结构区结合，miRNA可以对转录体切割降解，当不完全配对影响A型螺旋的形成时则表现出对转录体翻译抑制。Ago2具有的核酸内切酶活性还可以对靶mRNA碱基错配或环状突起碱基异常结构进行切割修饰。

Ago2在RNAs沉默途径中的抑制蛋白合成机制：Ago2在与miRNAs结合形成RISC后，靶向mRNA进入胞质处理小体（pbodies），进而通过3种方式抑制蛋白质合成：①诱导mRNA脱腺苷酸化和脱帽，启动mRNA降解；②通过Ago2和翻译起始因子竞争与mRNA M7G帽子的结合，阻碍功能性核糖体的装配，造成翻译起始抑制；③通过募集多肽链降解（翻译延伸）相关的细胞因子（肽酶、翻译后修饰酶）使核糖体脱离肽链或新合成的肽链迅速降解，这一过程发生在翻译起始后[12]。免疫荧光定位证明，Ago2大多定位于细胞质中，并在P小体中富集，参与上述的转录后水平的基因沉默。但仍有一小部分Ago2定位于细胞核中，它们作用于DNA启动子区域，使靶基因和组蛋白甲基化，从而抑制基因表达。最近发现Ago2介导的miRNA在无血清细胞的AU富集区域，可以增强转录本的翻译。有人估计，在人类基因组中大于30%的基因的表达都受与Ago相关的RNAi现象的调控[13]。探索Ago2在人类细胞，尤其是肿瘤细胞相关性研究已成为肿瘤的基因诊断和治疗的新亮点。

3 Ago2与肿瘤的关系

3.1 Ago2过表达与肿瘤的关系 Ago家族蛋白与多种肿瘤密切相关，hAgo1、hAgo3和hAgo4基因前后排列在人1号染色体p34～35，在wilms肾癌中经常缺失，还与神经外胚层瘤相关[14]。hAgo1在肺和肾的发育过程中高表达，在缺少wilms肿瘤抑制基因WT1的肾癌中过表达[15]。在对人类乳腺癌MCF7、宫颈癌Hela、肺腺癌A549和胚肾细胞HEK293这4种细胞系中Ago1～4的转录图谱显示，其细胞系普遍存在稳定表达，其中Ago2和Ago3转录水平较高且相对稳定。Zhang等[16]研究227例卵巢癌、乳腺癌及黑素瘤标本的miRNA表达谱，同时分析miRNA靶基因的DNA拷贝数，结果发现在3种肿瘤中Ago2的DNA拷贝数的变异率均明显增加。对乳腺癌的进一步研究显示：Ago2在侵袭性较高的乳腺癌、basellike、HER2过表达和luminal B型的表达增高，且在ER-乳腺癌表达高于ER+乳腺癌患者，说明Ago2过表达与乳腺癌的侵袭程度密切有关[17]。Li等用microarray的方法对150例结肠癌标本和癌旁组织标本Ago家族进行检测，发现Ago2在结肠癌中表达高于癌旁组织，提示Ago2的表达与肿瘤进展及侵犯有关[18]。

Cheng等在肝癌组织与相邻非肿瘤肝组织的对比研究中发现Ago2在肝癌组织中表达频繁上调[19]，有趣的是，Ago2的过度表达可以促进体内肝癌细胞的细胞增殖、克隆形成、迁移、致瘤性以及转移等；与此相反，Ago2的敲低可以限制非依赖性集落形成，迁移和肿瘤转移。Shaughnessy等用基因芯片技术研究了高危多发性骨髓瘤（MM）患者基因表达谱改变，确定了70个疾病早期死亡相关的基因，Ago2是其中一个，这证明Ago2的表达与MM早期死亡有关[20]。Parisi[21]等研究表明Ago1和Ago2在SHSY5Y神经母细胞瘤组织中过度表达且影响细胞的增殖，迁移和凋亡。国内研究证明：Ago2在结肠癌[22]、胃癌[23]、膀胱尿路上皮癌[24]等组织中的表达高于正常组织。

3.2 Ago2介导的RNA沉默途径与肿瘤的关系 在人类的RNA干扰中，Ago2是目前唯一具有RNA酶切活性的蛋白，控制miRNA和siRNA对靶mRNA的剪切分解，从这个角度说Ago2应该是惟一可能与肿瘤相关的蛋白。有人在MM患者miRNAs的表达谱中发现Ago2的表达增高与其DNA拷贝数增加密切相关，在高危组Ago2和大部分miRNAs表达均显著上调，与MM高危因素呈正相关性。Zhou发现，Ago2功能沉默后的骨髓瘤细胞株活性明显降低，用qPCR检测Ago2有活性和失活的骨髓瘤细胞株中miRNA的表达，发现Ago2失活后的细胞株miRNA功能下调[25]。但在骨髓瘤病例标本中，Ago2与miRNA的表达量没有显著的正相关，说明Ago2在骨髓瘤细胞中可能存在其他调节通路。进一步研究发现，Ago2介导的骨髓瘤细胞凋亡还可以通过caspasa3、caspasa8和caspasa9信号通路。Karanti对60例弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）标本和27种DLBCL细胞株，对与人类疾病相关的471种miRNA和涉及miRNA生成的17种基因进行研究[26]。结果发现，95%的淋巴瘤标本和100%的淋巴瘤细胞株miRNA基因异常，包括基因的增多和丢失。对17种参与miRNA合成的基因研究中发现，Ago2基因异常超过10%。

Chiyomaru等发现Ago2通过miR141介导HOTAIR基因沉默，他们通过转染Ago2的siRNA至786O细胞中的观察到Ago2的siRNA下调Ago2的表达和miR141减少内源性HOTAIR表达至20%，但是没有观察到Ago2敲低时HOTAIR的显著下降，表明HOTAIR基因沉默在很大程度上是Ago2通过miR141介导的[27]。

Zhang等发现在293T和H1299细胞系中稳定的Ago2的过度表达能引起miRNA和mRNA的表达特异性改变，但研究同时发现Ago2的表达在人肺腺癌组织中低于配对非癌组织[28]。可见变化的Ago2表达可能在体内引起显著的生理和病理变化。Naoghare等研究表明敲低Ago2能诱导骨髓性白血病细胞的凋亡和抑制在HEK293细胞系中癌基因转染的siRNA介导的基因沉默[29]。Ago2是miRNA从RNA靶分子上形成的一个关键因子，在恶性肿瘤的形成过程中，miRNA和Ago2的相互作用可能是复杂的，其可能机制是：作为RISC活性中心，Ago2的增多选择性保护了miRNA，防止其被降解，从而抑制抑癌基因的作用，促进肿瘤的生长。还有一种可能是：Ago2的表达除了促进肿瘤的生长外，还可引起表型的改变。

3.3 Ago2与肿瘤细胞周期的关系 人类肿瘤细胞中Ago2蛋白可直接或间接地参与细胞周期进程的调控。在人类基因组中大于30%的基因的表达都受与Ago相关的RNAi现象所调控。许多有RNAi通路控制的基因编码转录因子相关蛋白，从而调节信号通路和细胞周期进程。试验证明，Ago蛋白表达沉默会导致细胞增殖活性显著下降，生长受抑。Ago1～ Ago4基因沉默所致的细胞增殖活性随Ago下调时间的延长而持续下降。其中Ago2沉默所致的细胞生长抑制程度最大，可能与细胞周期进程的调控关系更为紧密。进一步研究揭示，Ago蛋白的表达缺失导致其细胞周期在G0/G1期发生停滞，细胞不能正常进入S期完成DNA复制，从而抑制增殖。Ago2蛋白也可通过miRNA途径间接的影响细胞正常生长增殖。最新发现，miRNA不仅可以靶向mRNA 3′UTR对蛋白质表达进行负控制[30-31]，还可以激活mRNA翻译[32]，而两种控制机制的转换则依赖于细胞周期的状态。如miR3693在G1期阻滞时激活转录，当细胞正常生长时则抑制转录。而无论正负调控都需要Ago2蛋白的参与，那么Ago2蛋白的缺失就可能会对miRNAs调控通路造成影响，进而影响细胞增殖。在人类肿瘤细胞中Ago2蛋白对其细胞生长和增殖起着至关重要的调控作用。Ago2蛋白表达沉默导致细胞增殖活性显著下降，细胞周期在G0/G1期发生阻滞，生长受抑。揭示Ago2蛋白可能直接或间接地参与细胞周期进程的调控。

4 小结与展望

siRNA/miRNA可通过抑制肿瘤发生、发展、侵袭、转移、细胞周期控制、信号转导和凋亡等过程中的特定和关键靶基因而发挥抗癌的作用，目前已在多种肿瘤治疗方面取得成效。但是，从已知的超过2 000个与肿瘤相关的编码基因中寻找肿瘤生物治疗特异而有效地靶基因有较大的难度。在人类的miRNA和siRNA的形成过程中，Ago2蛋白的结合是其关键步骤，因而Ago2应该是惟一可能与肿瘤相关的蛋白。诸多研究数据亦证明Ago2基因在肿瘤中的复制时增强的。Ago2介导的siRNA/miRNA调控通路为肿瘤的基因治疗提供了一种新的具有高效性和高度特异性的研究策略，其干扰治疗肿瘤的主要原理为在特定的组织细胞中引入双链RNA，诱导序列特异的靶基因的沉默，从而迅速阻断基因活性。然而，到目前为止，Ago2基因和蛋白仍有许多功能不为人所知，需要我们继续探索、发现。

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