响应面法优化重组毕赤酵母菌表达β甘露聚糖酶的诱导条件

李慧玲 刘祖艳 赵敏

摘要 [目的]对重组毕赤酵母菌表达β甘露聚糖酶的诱导条件进行优化。[方法]以重组毕赤酵母GS115为研究对象，通过单因素试验确定最佳产酶条件，并采用响应面试验确定3个因素的最佳水平。[结果]最佳产酶条件为：培养温度28 ℃，培养pH 6.5，摇床转速210 r/min，培养基装液量100 ml。响应面试验确定3个因素即装液量、甲醇添加量和pH最佳值分别为103.18 ml、1.77%和6.69；在此条件下，β甘露聚糖酶的活力最大值为4 917.5 U/ml。[结论]验证试验证明模型预测值准确、可靠，为重组毕赤酵母菌的合理开发利用提供了依据。

关键词 重组毕赤酵母；β甘露聚糖酶；响应面

中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03153-03

Abstract [Objective] To optimize the induction conditions of the recombinant Pichia pastoris βmannanase. [Method] With recombinant Pichia pastoris GS115 as study object， the optimal enzyme producing conditions and three factors optimal level were determined by single factor experiment and response surface experiment respectively. [Result] The optimum enzyme producing conditions are： temperature 28 ℃， pH 6.5， rotating speed 210 r/min， volume of medium 100 ml. Response surface methodology was used to optimize the above three factors（volume of medium， methanol concentration， pH of medium）with the optimum value 103.18 ml， 1.77%， 6.69， respectively. The βmannanase activity would reach the highest value（4 917.5 U/ml） under the optimized fermentation conditions. [Conclusion] The predicted values from the response surface methodology were proved to be correct and reliable by verification test， which will provide a reference for appropriate utilization and development of recombinant Pichia pastoris.

Key words Recombinant Pichia pastoris； βmannanase； Response surface methodology

β1，4D甘露聚糖酶（β1，4Dmannan mannanohydrolase，EC 3.2.l.78），简称为β甘露聚糖酶（βmannanase）属于半纤维素酶类，可以断裂β1，4D甘露糖苷键[12]。β甘露聚糖酶广泛应用于纸浆、饲料和钻井等生产领域[3-6]。

β甘露聚糖酶存在于细菌、酵母菌、丝状真菌和植物中[6]。来自于细菌的β甘露聚糖酶已被分离得到，如Bacillus subtilis WY34、Cellulosimicrobium sp.strain HY13、Sphingomonas strain等[7-9]。克隆细菌的β甘露聚糖酶并且高效异源表达有助于满足工业生产的需求。甲醇营养型毕赤酵母成功作为高水平表达异源蛋白的表达系统[10-11]。

笔者为了使构建的重组毕赤酵母表达β甘露聚糖酶潜力充分发挥出来，优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度。研究选用装液量、甲醇添加量和pH值3个关键因素为自变量，以重组β甘露聚糖酶的酶活力为响应值，利用响应面法（response surface methodology，RSM）进行发酵条件优化并确定最佳方案，以期为重组毕赤酵母的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株。分泌表达β甘露聚糖酶的重组毕赤酵母菌Man12，由东北林业大学微生物与免疫实验室保存。

1.1.2 主要试剂。培养基的配制方法参见Invitrogen公司《毕赤酵母操作手册》。

1.2 方法

1.2.1 菌株的诱导表达。取-80 ℃冰箱保存的甘油菌接种于YPD培养基中，划线活化，28 ℃倒置培养。挑取菌株接种至BMGY培养基中培养16～18 h至OD600=2～6，离心收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD600=1.0左右；取菌液继续震荡培养，每隔24 h加入无水甲醇诱导，诱导72 h，测定酶活性。

1.2.2 粗酶液的制备。取诱导表达Man12菌株培养液，离心后上清液即为粗酶液。

1.2.3 重组β甘露聚糖酶活力测定方法。采用改进的3，5-二硝基水杨酸法（DNS方法）测定酶活力[12]，利用比色法测定酶解后还原产物的生成量，以表示酶的活力。酶活力定义：在一定温度和pH下，以每分钟生成相当于1 μmol D甘露糖所需酶量为一个酶活力单位（IU）。

1.2.4 培养温度对重组毕赤酵母产酶的影响。重组毕赤酵母菌分别在24、26、28、30和32 ℃条件下培养，以确定最佳培养温度。

1.2.5 甲醇浓度对重组毕赤酵母产酶的影响。在BMGY培养基中分别添加浓度为0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%和2.50%的甲醇，诱导培养72 h后测定酶的活力，以确定甲醇的最佳添加量。

1.2.6 不同pH值对重组毕赤酵母产酶的影响。通过添加0.1 mol/L的磷酸钾缓冲液使培养基的pH值分别达到3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的培养基，经甲醇诱导表达72 h后测定酶的活力，以获得发酵培养最佳pH值。

1.2.7 摇床转速对重组毕赤酵母产酶的影响。重组毕赤酵母菌摇床培养时转速分别设定为180、190、200、210、220和230 r/min，进行培养。

1.2.8 培养基装液量对重组毕赤酵母产酶的影响。分别将50、70、100、110、120和130 ml经BMMY重悬的菌液装入500 ml三角瓶中培养，测定酶活，获得最佳装液量。

1.2.9 响应面优化发酵条件。利用DesignExpert软件进行装液量、甲醇添加量和培养基pH3个条件的响应面分析，以β-甘露聚糖酶酶活力为响应值。

随着装液量和pH的增加，酶活变化是先升高后降低。方差分析表明，装液量和pH交互作用不显著（P>0.05）。图7表明，甲醇加入量是1.5%时，随着装液量的增加，酶活逐渐降低，因为摇瓶培养时，液体过多，酵母菌通气不畅，影响其正常生长，所以酶活下降。当甲醇加入量是达2.1%以上时，随着装液量的增加，酶活变化不大，推测原因是甲醇诱导外源基因大量表达，所以产酶较多。方差分析表明，甲醇加入量和装液量交互作用极显著（P<0.01）。图8表明，当甲醇添加量为1.5%时，随着pH值的增加，酶活先升高后降低；当甲醇添加量是2.3%时，趋势相同。毕赤酵母是成功的表达系统，已得到广泛应用。不同毕赤酵母产外源

蛋白的培养条件有一定差别，需要后期优化其发酵条件，以获得更多的表达产物。

3 结论

试验利用响应面分析方法优化重组酵母菌摇瓶培养条件，最终获得产酶最优条件为：培养温度为28 ℃，摇床转速是210 r/min，装液量是103.18 ml（500 ml三角瓶）、甲醇加入量为1.77%、pH是6.69，为重组毕赤酵母的中试发酵生产奠定基础。

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