高效液相色谱荧光检测法检测鸡组织中氨苄西林残留量

摘要 [目的] 为氨苄西林在鸡组织中的残留检测标准的制定提供科学依据。[方法] 建立检测鸡组织中氨苄西林残留量的高效液相色谱荧光法。[结果] 氨苄西林在25～1 000 μg/kg 浓度范围内，色谱峰面积与浓度呈线性关系，且线性关系良好。当氨苄西林添加量为10.0～125.0 μg/ml时，鸡组织中AMP的平均回收率为71.23%～88.86%，相对标准偏差均低于10.74%；检测限和定量限分别为3.5（S/N=3）和10.0 μg/kg（S/N=10）。[结论] 该方法操作简便快速，可适用于鸡组织中氨苄西林的提取和检测，且准确度和精密度均符合残留分析的要求。

关键词 高效液相色谱；氨苄西林；荧光检测法

中图分类号 S851.34+7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）20-06615-03

Determination of Residual Amount of Ampicillin in Chicken Tissues by HPLC with Fluorescence Detection

SUN Lirui， XIE Kaizhou et al

（College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract [Objective] The research aimed to provide scientific basis for establishing the standards for detecting the residue of ampicillin （AMP） in chicken tissues. [Method] A high performance liquid chromatography with fluorescence detection （HPLCFLD） method was established for detecting the residual amount of ampicillin （AMP） in chicken tissues.[Result] The chromatographic peak area showed a good linear relationship with ampicillin concentration in the range of 25-1 000 μg/kg. When the addition amount of ampicillin was 10.0-125.0 μg/kg， the average recovery rate of AMP in chicken tissues was 71.23%-88.86%， with RSD of less than 10.74%. Limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） were 3.5 μg/kg （S/N=3）and 10 μg/kg（S/N=10）， respectively. [Conclusion] This HPLCFLD method was simple and rapid， and it was suitable for the extraction and determination of ampicillin in chicken tissues. And the accuracy and precession could meet the demands of residual analysis.

Key words HPLC； Ampicillin （AMP）； Fluorescence detection

氨芐西林（Ampicillin）又称氨苄青霉素，是在天然青霉素结构基础上改造而来的β-内酰胺类抗生素，对大多数革兰氏阴性菌具有较强的杀菌作用。与其他抗生素相比，氨苄西林具有抗菌谱广、耐酸碱、价格低廉等优点，广泛用于养殖业。然而，氨苄西林在动物体中利用率低，大部分以原体或者代谢物的形式从动物体中排泄到环境中，进而危害人类健康[1-2]。许多国家已经对家禽组织中的氨苄西林最高残留限量（MRLs）做出了规定[3-4]，规定鸡组织中的MRLs不应超过50 μg/kg。因此，研究鸡组织中氨苄西林的残留快速检测方法具有重要的意义。

目前，国内外关于鸡组织中氨苄西林残留检测的方法虽已有报道[5-7]，但运用高效液相荧光检测法检测鸡组织中氨苄西林残留的方法尚未见报道。笔者尝试建立鸡组织中氨苄西林检测的高效液相色谱荧光检测法，旨在为氨苄西林在鸡组织中的残留检测标准的制定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 标准品、主要试剂及其配制

氨苄西林标准品，纯度99%，德国Labor Dr. EhrenstorferSchaefers，批号为C10243080；氨苄西林原粉，纯度97.62%（实测含量），购自江苏倍康药业有限公司；乙腈，色谱纯，购自美国Sigma有限公司；磷酸二氢钾，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；三氯乙酸，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；水杨醛，分析纯，购自Aladdin Chemistry Co. Ltd；超纯水，由ELGA公司超纯水仪制备，电阻率为18.2 MΩ，符合国家试验室用水规格（GB 6682-1992）。

氨苄西林标准储备液：准确称取氨苄西林标准品10.10 mg，置于10 ml棕色容量瓶中，用超纯水溶解并定容，配制成 1.00 mg/ml的氨苄西林标准贮备液，-34 ℃下保存，可稳定保存2个月。

1.2 主要仪器

高效液相色谱仪（型号Waters515，配备2台515型高压泵、2475型荧光检测器、柱温箱和色谱工作站等，购自美国Waters公司）；荧光分光光度计（型号日立F-4500，购自日本日立公司）；紫外分光光度计（型号UV-2401，购自日本岛津公司）；高速冷冻离心机（5810R型，购自德国Eppendof公司）；高速离心机（5804R型，购自德国Eppendof公司）；超纯水制备仪（Purelab Option，购自英国ELGA公司）；恒温磁力搅拌器（521-2型，购自上海司乐仪器有限公司）；无油真空泵（AP-01型，购自天津奥特塞恩斯仪器有限公司）；组织匀浆机（型号ART MICCRA D-9，购自德国ART-moderne Labortechnik e.k.公司）等。

1.3 试验动物的分组及样品采集

16周龄京海黄鸡72只，公、母各半，随机分成2组，分别为氨苄西林投药组（54只）和空白对照组（18只）。试验鸡均单笼饲养，给药前分别称重并编号。试验前预饲7 d，饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料（自制于江苏京海禽业集团有限公司饲料厂），自由饮水。试验组鸡按体質量以120 mg/（kg·d）的剂量给药。于停药后4 h各试验组取6只鸡进行屠宰试验，分别取两侧胸肌肉、全肝和全肾，于-34 ℃冰箱中保存待测。

1.4 试验方法

1.4.1

样品的提取与净化。准确称取3.0 g剪碎后的鸡肌肉（或肝脏或肾脏）组织，置于50 ml的具塞离心管中，添加0.01 mg/L的磷酸二氢钠溶液（pH 4.5）3 ml，17 000 r/min匀浆30 s。添加8 ml乙腈冲洗匀浆刀头并转入匀浆液中，振荡混匀，水浴超声辅助萃取15 min。4 ℃下10 700×g离心15 min，转移上清至另1个干净离心管中。在残渣中再加入2 ml磷酸二氢钠溶液重复提取1次，匀浆后再添加8 ml乙腈，振荡混匀，超声萃取10 min，合并上清液。添加5 ml用75%乙腈饱和的正己烷，振荡混匀后静置并去除上层溶液，重复去脂1次。添加15 ml超纯水饱和的二氯甲烷溶液，振荡，10 700×g离心5 min后，转移上清液至10 ml玻璃管中。

1.4.2

样品的衍生化。将玻璃管中收集的上清液超声脱气15 min，然后置于真空干燥器中浓缩至干。向玻璃离心管中加入超纯水1 ml，然后分别加入20%的三氯乙酸溶液200 μl、甲醛20 μl，漩涡混匀20 s，100 ℃水浴加热30 min。反应后取出样品，水浴冷却，将样品转移到2 ml离心管中，并用磷酸二氢钾/乙腈（V∶V=60∶40）混合溶液洗涤玻璃管2次，合并到2 ml离心管中，并定容至2 ml刻度。12 100×g离心15 min，取上清液供高效液相色谱分析。

1.4.3

色谱操作条件及参数。色谱柱：CNWAthenaC18WP柱，粒径5 μm，4.6 mm ×250 mm i.d.；保护柱：C18柱，5 μm；流动相-乙腈：KH2PO4溶液（0.01 mol/L，pH 5.5，V/V）；流速为1.0 ml/min；激发波长327 nm，发射波长409 nm；柱温为40 ℃；进样体积为200 μl。

1.4.4

标准曲线的制备。吸取标准储备液适量，依次用空白基质提取液稀释成浓度分别为25（0.5 MRL）、50（1 MRL）、100（2 MRL）、150（3 MRL）、250（5 MRL）、500（10 MRL）和1 000 μg/kg（20MRL）的标准工作液。各个浓度点准确量取1 ml，按衍生化反应步骤衍生，得到系列浓度的氨苄西林衍生产物，在选定的色谱条件下，按浓度从低到高的顺序分别进样200 μl进行HPLC分析，每个浓度重复4次，取平均值。以峰面积（A）为纵坐标，以标准溶液的质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，以此曲线作为待测样品的定量曲线，并求出其回归方程和相关系数。

1.4.5

回收率及精密度的测定。采用标准添加法，取剪碎的空白组织（鸡肌肉、肝脏、肾脏）样品，置于50 ml聚丙烯离心管中，添加适宜浓度的AMP标准溶液，使组织样品中药物浓度分别为10、25、50和100 μg/kg，室温下静置30 min，作为空白添加试样，每个浓度水平设置6个平行，经“1.4.1”和“1.4.2”的方法处理后，供HPLC测定，外标法定量，计算出回收率。将回收率检测剩余的样品按4个不同浓度合并成4份，得到4组不同药物浓度的样品。在同一天内不同时间用同一条标准曲线及同一台高效液相色谱仪6次重复测定4组药物浓度的样品，计算日内（批内）精密度。在1周内不同天用不同的标准曲线及同一台高效液相色谱仪6次重复测定4组药物浓度的样品，计算日间（批间）精密度。

1.4.6

检测限和定量限的测定。分别用空白肌肉、肝脏、肾脏按“1.4.1”中步骤制取空白基质提取液，再分别向其添加一定浓度的氨苄西林标准溶液，按“1.4.2”中步骤对样品进行衍生化，取上清液进行HPLC分析，以信噪比（S/N）为3和10分别作为药物在鸡组织中的检测限（LOD）和定量限（LOQ），并计算LOQ浓度点的回收率及相对标准偏差（RSD），验证其可靠性[8]。

1.4.7

鸡组织中氨苄西林的测定。按外标法，将鸡组织（肌肉、肝脏、肾脏）中所测定的氨苄西林色谱峰面积带入基质标准曲线，得到鸡组织中氨苄西林的残留量。

2 结果与分析

2.1 色谱分离

在优化的色谱条件下，测得鸡肌肉、肝脏、肾脏中AMP的保留时间分别约为7.31、7.30和7.31 min，色谱峰峰形较佳，峰间隔时间较长，且均为基线分离峰。空白提取液在上述时间无干扰峰出现，以鸡肝脏中AMP的高效液相色谱图为例，具体见图1。

2.2 标准曲线

以氨苄西林的色谱峰面积（Y）对进样前氨苄西林的质量浓度（X）作图，得到其标准曲线。氨苄西林在25～1 000 μg/kg质量浓度范围内，色谱峰面积与浓度呈线性关系，且线性关系良好。氨苄西林的线性回归方程、相关系数和线性范围见表1。

2.3 样品的回收率及精密度

由表2可知，在添加水平分别为10、25、50和100 μg/kg时，鸡肌肉样品中AMP的平均回收率为76.53%～85.87%，相对标准偏差为5.48%～8.82%；鸡肝脏样品中AMP的平均回收率为75.31%～83.31%，相对标准偏差为6.29%～10.20%；鸡肾脏样品中AMP的平均回收率为78.76%～84.26%，相对标准偏差为5.46%～9.29%。通过对样品精密度进行测定发现，氨苄西林在鸡肌肉、肝脏和肾脏中的日内相对标准偏差分别低于8.77%、9.21%和8.99%；日间相对标准偏差分别低于12.78%、11.64%和12.54%，结果表明该方法可靠，重复性高。

2.4 灵敏度

应用该试验建立的检测方法测得鸡组织（肌肉、肝脏和肾脏）中氨苄西林的检测限和定量限均分别为3.5（S/N=3）和10.0 μg/kg（S/N=10）。由表2可知，添加濃度为10.0 μg/kg时，氨苄西林在鸡组织中的回收率均大于70%，相对标准偏差均小于20%，表明该方法在定量限水平的可靠性好[8]，且灵敏度高，完全能满足氨苄西林在鸡组织中残留检测的需要。

3 讨论

3.1 样品提取方法的选择及优化

动物源食品中基质干扰复杂，富含大量脂肪和蛋白质，选择并优化样品前处理方法对结果的准确性显得尤为重要。样品的提取的目的在于同时去蛋白和萃取目标化合物。Capriotti等[9]分别比较了用80∶20（V/V）的甲醇：水、乙腈：水、丙酮：水提取鸡蛋中的多种抗生素残留，3种提取溶剂提取氨苄西林的回收率分别为27%、19%

和0%；还比较了酸性的磷酸盐缓冲液提取液以及中性的甲醇和水混合提取液的提取效果，前者的回收率高。笔者经过预试验比较了乙腈和甲醇的去蛋白提取药物的效果，发现用乙腈的效果要较甲醇好，这可能与样品基质的不同有关。样品提取后，为了阻止氨苄西林与大分子形成共价键，阻碍衍生反应的进行，再次加入乙腈沉淀蛋白并去除非极性干扰物。采用该方法提取的回收率均在70%以上，可满足兽药残留分析的要求。

42卷20期 孙礼瑞等 高效液相色谱荧光检测法检测鸡组织中氨苄西林残留量

3.2 样品净化方法的选择及优化

样品经提取后提取液中目标分析物含量较低，且许多与待测组分溶解性相似的杂质将被一起转移出来，故该试验在对样品进行提取和沉淀蛋白后还需要进行净化。目前兽药残留分析较常用的净化方法有固相萃取法和液液萃取法，目前国内外多数分析试验的前处理过程采用固相萃取装置[10-14]。笔者在净化阶段对比了不同SPE小柱对分离效果的影响，发现应用SPE小柱进行净化的回收率为63%～92%，而采用乙腈去除蛋白，正己烷脱脂，然后利用氨苄西林易溶于水中，而不溶于二氯甲烷的性质，用二氯甲烷对有机试剂进行萃取去除，从而达到分离效果，回收率可达68.65%～88.86%，操作简单且完全能满足农业部关于《兽药残留试验技术规范》的要求[15]。考虑到经