注射用氨苄西林钠含量测定方法的优化

王雪静

(贵州省兽药饲料监察所，贵州 贵阳 550003)

注射用氨苄西林钠属于β-内酰胺类抗生素，是临床常用的半合成青霉素，性状为白色或类白色的粉末或结晶性粉末，适用于敏感菌所致的胃肠道感染、呼吸道感染、尿路感染、软组织感染、心内膜炎、脑膜炎、败血症等。《中华人民共和国兽药典》2015年版一部中记载注射用氨苄西林钠的含量采用的是HPLC法，改进方法采用230 nm波长，进样20μL，流速1.0 mL/min，流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钾-甲醇(60∶40)，柱温30 ℃，并对方法的准确度、精密度、稳定性、线性和回收率进行了研究。

1 实验

1.1 仪器和试药

仪器设备：Denver instrument TB-215 D型电子分析天平(美国丹佛公司)；Agilent 1260 infinity 高效液相色谱仪(配紫外检测器)；色谱柱为Waters Symmetry C18色谱柱。对照品：氨苄西林，中国兽医药品监察所，批号：K0211410，含量86.0 %。试验样品：注射用氨苄西林钠，厂家：齐鲁动物保健品有限公司，规格：1.0 g批号：1808010。试剂：甲醇为色谱醇；水为高纯水；磷酸二氢钾为分析纯。

1.2 方法

采用高效液相测定注射用氨苄西林钠含量的方法，以C18色谱柱，0.05 mol/L磷酸二氢钾-甲醇(60 ：40)为流动相，流速为1.0 mL/min，进样量20 μL，测定波长230 nm，柱温30 ℃，从线性、精密度、稳定性、添加回收、准确度五个方面来进行方法学验证。

对照品溶液的制备：精密称取对照品氨苄西林50 mg置于50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得氨苄西林浓度为1.0 mg/mL的对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液2 mL置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得氨苄西林浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液的配制：精密称取样品50 mg置50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度摇匀。另取上述溶液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2 结果与讨论

2.1 含量测定

色谱条件：流动相0.05 mol/L磷酸二氢钾-甲醇(60 ∶40)；流速1.0 mL/min；进样量20 μL；测定波长230 nm；柱温30 ℃。在此色谱条件下，混合对照品溶液和供试品溶液色谱图见图1、图2。

图1 对照品溶液色谱图

图2 供试品溶液色谱图

2.2 线性范围

精密取氨苄西林对照品贮备液适量，加流动相稀释，制得含氨苄西林浓度分别为50、100、200、300、500 μg/mL的对照品溶液系列。精密吸取各对照品溶液 20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以氨苄西林色谱峰面积(Area)，对其相应浓度(Amt，μg/mL)进行线性回归，求得回归方程：Area = 9.5819 ×Amt + 34.367，R2 = 0.9999结果表明氨苄西林在50～500 μg/mL内与其峰面积线性关系良好。

2.3 精密度试验

精密量取氨苄西林浓度0.2 mg/mL的对照品溶液20 μL连续测定6次，以测定结果峰面积的相对标准偏差表示试验的精密度，氨苄西林色谱峰面积的RSD为0.1 %，表明方法的精密度良好。

2.4 溶液稳定性试验

精密量取氨苄西林浓度0.2 mg/mL的对照品溶液20 μL，分别约于0、2、4 h上机测定，每次进样两针，氨苄西林色谱峰面积平均值的相对标准偏差为0.4 %。结果表明溶液在4 h内基本稳定。

2.5 添加回收试验

精密称取供试品50 mg，置50 mL量瓶中，得供试品浓度为1.0mg/mL的贮备液，精密量取供试品贮备液和氨苄西林对照品贮备液各2 mL置于20 mL容量瓶中，加流动相定容，做6个平行。得最终上机浓度为0.2 mg/mL，测定计算回收率，数据见表1，结果表明回收率良好。

表1 氨苄西林回收率试验结果

2.6 样品准确度的测定

取样品按供试品溶液的制备方法分别制成供试品溶液后进行含量测定，每批样品作两个平行，结果与药典方法测量结果进行比较，计算氨苄西林的相对偏差(CV)，相对偏差为0.6 %。

2.7 讨论

《中华人民共和国兽药典》2015年版一部中记载注射用氨苄西林钠的含量测定方法，采用HPLC法但流动相相当复杂，流动相A为12 %醋酸溶液-0.2 moL/L磷酸二氢钾溶液-乙腈-水(0.5∶50∶50∶900)；流动相B为12 %醋酸溶液-0.2 moL/L磷酸二氢钾溶液-乙腈-水(0.5∶50∶400∶550)，流动相A-流动相B(85:15)为上机流动相，此法的流动相配制复杂，实验结果色谱图中出现峰形不对称、倾斜的现象。依据《兽药质量标准》2017年版化学药品卷中记载的氨苄西林钠可溶性粉含量测定的方法，检测波长230 nm，以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾(50∶50)为流动相，由此启发得到注射用氨苄西林钠含量测定的改进方法，采用检测波长230 nm，流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钾-甲醇(60 ∶40)，配制简单。原方法采用的是254 nm，上机浓度为1.0mg/mL，进样20μL，峰面积是1000左右，改进方法采用的是230nm，上机浓度为0.2 mg/mL进样20μL，峰面积为1 000左右，氨苄西林在230 nm比254 nm时吸收更大，上机浓度低节约药品。

3 结论

注射用氨苄西林钠含量测定的HPLC改进方法采用230 nm波长，进样20μL，流速1.0 mL/min，流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钾-甲醇(60∶40)，柱温30 ℃，流动相配制简单，峰面积较大，出峰时间较短，若仅是测含量，可以采用优化后的方法。