丹参酚酸类成分生物合成途径研究进展

韩立敏

摘要 酚酸类成分是丹参的一大类活性成分，具有重要的生理意义，从丹参酚酸类成分的生理活性、生源途径、生源途径关键酶基因研究等方面进行了归纳总结，提出了有待深入研究解决的问题，为丹参酚酸成分的生物合成及其调控研究奠定基础。

关键词 丹参；酚酸类成分；生物合成；关键酶基因

中图分类号 S188 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）20-06562-03

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科鼠尾草属多年生草本植物，以其干燥根及根茎入药，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效[1]。丹参的生理活性成分按其溶解性的不同分为两大类：一类是脂溶性成分，另一类是水溶性成分。丹参酮 I、丹参酮 IIA、丹参酮 IIB、隐丹参酮、丹参酸甲酯、紫丹参素等均属脂溶性成分；丹参的水溶性成分主要是指一些酚酸类化合物，包括丹参素、紫草酸、丹酚酸B和迷迭香酸等[2]。鉴于中医传统用药方法是用其水煎剂，即丹参的水溶性部位，因此，研究丹参水溶性成分的生物合成及其代谢调控具有重要意义，成为近年来的研究热点。

1 丹参酚酸类化合物的药理活性

丹参水溶性酚酸类成分具有重要药理作用，尤其是迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A和丹酚酸B，现代药理研究发现，丹参的水溶性成分具有抗炎、抗菌、抗血栓、改善微循环、促进组织恢复、抗脂质过氧化和清除自由基等多种生理活性，在抗肝脏损伤、抗动脉粥样硬化等方面具有一定的疗效[3-5]。因此，丹参酚酸类成分是极具价值的药用资源，蕴藏着巨大的市场潜力，为更好地利用这一资源，阐明它们的生物合成途径并应用于实际生产具有重要意义。

2 丹酚酸类成分的生物合成途径

早在1993年，PETERSEN等[6]利用彩叶草的悬浮培养细胞，第一次比较全面地阐述了迷迭香酸的生源途径及途径上相关酶，丹参中的主要水溶性酚酸类成分在结构上与其具有相似性，大部分都是在迷迭香酸的结构上进一步衍生化得到，因此在生源途径上也应有一定的关联，但具体的生源途径尚不完全清楚。目前普遍认为，丹参酚酸类次生代谢物主要合成于两条代谢途径——苯丙烷代谢途径和迷迭香酸代谢途径（图1A）[7]，ZHANG等[8]研究了丹参毛状根在茉莉酸甲酯和真菌提取物处理下丹酚酸合成途径关键酶基因的响应情况，认为酪氨酸途径与迷迭香酸的合成相关性更大[8]。2012年上海第二军医大学邸鹏[9]利用13C同位素标记动态监测的方法对迷迭香酸生源途径进行了重新评估，认为咖啡酰CoA与4羟基苯乳酸在丹参迷迭香酸合成酶（SmRAS）催化下生成咖啡酸4羟基苯乳酸，颠覆了之前人们对此途径的认识（图1B）。2013年，陕西学前师范学院植物次生代谢课题组对丹参酚酸类成分的合成途径再次进行了修正，SmRAS催化4香豆酰CoA与丹参素合成4香豆酰3，4二羟基苯乳酸，而后在丹参细胞色素P450酶（SmCYP98A14）的作用下转化为迷迭香酸，再经过多步反应生成丹酚酸B（图1C）[10]。

关于丹参酚酸类成分生源途径，人们认识比较清楚的是迷迭香酸的上游，但迷迭香酸代谢通路还有不确定的步骤，即SmRAS底物和产物，对此仍需进一步研究证实。丹酚酸B如何由迷迭香酸转化而来目前仍不清楚，研究成果很少，从迷迭香酸到丹酚酸B的代谢通路研究有待突破。

3 丹参酚酸类化合物生物合成途径上相关酶基因

3.1 苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL）

苯丙氨酸裂解酶（phenylalanine ammonialyase EC 4.3.1.24）是催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，是苯丙烷类化合物代谢的关键酶和限速酶。在丹参迷迭香酸生源途径中 PAL 是丹参从初生代谢途径向次生代谢途径进入的位点酶和限速酶[11]。

SONG等[12]将丹参苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL）干涉后发现丹参中迷迭香酸和丹酚酸 B 的含量显著下降，且植株的表型发生变化，从而证实了 PAL 在迷迭香酸合成过程中的重要性。之后，人们对丹参苯丙氨酸解氨酶基因的功能及其表达调控进行了大量研究。MeJA处理可以显著提高SmPAL酶活性，促进丹参培养细胞中迷迭香酸（RA）的生物合成[13]。适宜浓度的 Ca2+处理可以通过影响迷迭香酸合成途径中关键酶 PAL 活性从而显著提高丹参培養细胞中迷迭香酸的合成积累量[14]。水杨酸（SA） 处理可有效诱导丹参培养细胞中PAL活性升高以及丹酚酸B 的合成与积累[15]，但SmPAL受热胁迫影响表达量下降[16]。

图1 丹参酚酸类成分的生物合成途径

3.2 肉桂酸4羟化酶基因（SmC4H）

肉桂酸 4羟化酶（cinnamate 4monooxygenase EC 1.14.13.11 ）是一种 P450 单加氧酶，是第一个被克隆并确定了功能的植物 P450[17]。其催化苯丙烷途径中4肉桂酸向4香豆酸转化，催化反式肉桂酸对位羟基化，与下游产物如木质素、类黄酮等许多代谢物的合成有关。研究表明，在丹参毛状根中过量表达SmC4H能够显著提高丹酚酸 B 的含量[18]，而热胁迫导致SmC4H表达量下降，丹参中的迷迭香酸和丹酚酸B含量下降[15]。在大肠杆菌BL21中表达 SmC4H基因，重组蛋白诱导表达效果较好，但主要以包涵体形式存在[19]。

3.3 4香豆素辅酶A连接酶基因（Sm4CL）

4香豆酸：辅酶 A 连接酶（4Coumarate：CoA ligase EC 6.2.1.12）催化肉桂酸及其衍生物产生相应的CoA 酯，为植物苯丙氨酸途径中的关键酶。在丹参中该酶的编码基因Sm4CL 以基因家族形式出现，研究较多的是Sm4CL1 和Sm4CL2[20]。对2个Sm4CL和不同底物的亲和性试验表明，Sm4CL1 对香豆酸亲和性较高，Sm4CL2 对咖啡酸亲和性较高，这也与化合物在不同细胞器及不同时间段积累有关。热胁迫条件下Sm4CL表达量呈先上升后下降趋势[15]。

3.4 酪氨酸氨基转移酶基因（SmTAT）

酪氨酸氨基转移酶（tyrosine aminotransferase EC：2.6.1.5）是酪氨酸途径上的第一个关键酶，可将酪氨酸转化为 4羟基苯丙酮酸。目前已从多种植物中克隆得到TAT基因，如丹参、彩叶草、大豆、苜蓿和拟南芥[21-22]。

丹参 SmTAT 基因序列包含 6 个外显子和 5 个内含子，其启动子和终止子包含多个基因调控元件。该基因在丹参根、茎、叶中均有表达，且茎中的表达比叶和根高。热胁迫、茉莉酸甲酯、脱落酸、水杨酸和紫外照射处理分别在一定程度上上调SmTAT 转录水平的表达，研究表明，丹参毛状根中过量表达SmTAT 能够显著提高迷迭香酸的积累，改变迷迭香酸和丹酚酸 B 的构成比例[18]。焦蒙丽等[23]研究了水杨酸对丹参酪氨酸氨基转移酶活性的影响并探讨了影响其酶活性的分子机制。

3.5 羟苯基丙酮酸还原酶基因（SmHPPR）

对羟基苯丙酮酸还原酶（hydroxyphenylpyruvate reductase.EC 1.1.1.237） 是迷迭香酸生物合成途徑中第一个使代谢流特异流向迷迭香酸的关键酶[24]。KIM 等[24]对彩叶草悬浮细胞中的 HPPR 蛋白进行分离纯化，并克隆得到该物种中的 HPPR 全长 cDNA 序列，异源表达得到酶蛋白，该蛋白既可催化对羟基苯丙酮酸转成对羟基苯乳酸，又可催化 3，4二羟基苯丙酮酸转化成3，4二羟基苯乳酸。SmHPPR在丹参根茎叶均有表达，茎中最强，根次之，叶表达量最少，该基因受茉莉酸、脱落酸、水杨酸及活性氧族信号的调控，其转录表达水平受MeJA、SA、ABA 和赤霉素上调，UVB 和双氧水处理能下调其转录表达水平[25]，在热胁迫处理下SmHPPR表达量前期变化不大，后期呈下降趋势。在丹参毛状根中，过量表达SmHPPR 及共表达 SmTATSmHPPR 均能显著提高迷迭香酸和丹酚酸 B 的含量[18]。

3.6 迷迭香酸合成酶基因（SmRAS）

迷迭香酸合成酶（rosmarinate synthase EC：2.3.1.140））首次分离于彩叶草[26]，目前研究较少，只有彩叶草、熏衣草和蜜蜂花中的迷迭香酸合成酶有报道[27-28]。迷迭香酸合成酶将 4香豆酰 CoA 与 4羟基苯乳酸共同催化生成 2氧（4香豆酰）3（4羟基苯）-乳酸，这是迷迭香酸生物合成的关键步骤。现已从丹参中得到迷迭香酸合成酶基因，并对其表达调控和功能进行了初步研究。SmRAS（ADA60182）编码 428个氨基酸，其在根中表达最高，茎中次之，叶中的表达最低，SmRAS 的表达受茉莉酸甲酯的调控，茉莉酸甲酯处理10 h 其表达量达到最高，为初始表达水平的 10 倍左右，而后至 24 h下降到初始表达水平的 5 倍左右。构建SmRAS RNAi载体，转至丹参毛状根中，基因的表达干涉使得丹参毛状根中的酚酸类成分积累受到明显影响，下降最明显的I5株系的迷迭香酸和丹酚酸B分别为对照的20%和30%，初步阐述了该基因在丹参酚酸类成分合成中的作用[9]。

RAS是一个多基因家族，目前只研究了一条SmRAS，2013年9月NCBI上公布了5条新的SmRAS家族成员，目前已全部克隆得到。对比6条SmRAS基因编码的氨基酸序列发现，它们在RAS特有的肽段DEDYL上有很大差异，SmRAS2、SmRAS3、SmRAS4和SmRAS6在该处的氨基酸是NDEL，SmRAS1在该处的氨基酸是DEDYL，而SmRAS5的是KDEYL[29]，因此，到底哪一条SmRAS4在丹参迷迭香酸的生物合成中贡献最大，SmRAS的关键催化活性位点还有待于进一步深入研究。

3.7 细胞色素P450酶基因（SmCYP98A14）

CYP98A14（coumaroyl 3′monooxygenase EC：1.14.13.36）是细胞色素 P450 酶，在迷迭香酸合成过程中将 SmRAS 催化 4香豆酰 CoA 与 4羟基苯乳酸生成的 2氧（4香豆酰）3（4羟基苯）乳酸在 3 位和 3位添加羟基从而生成迷迭香酸。

目前已经从彩叶草中分离得到 CYP98A14 基因并验证了功能[30]。邸鹏[9]克隆了SmCYP98A14，对其组织表达特异性和表达调控进行了研究，通过该基因的干涉和过表达初步研究了其在植物体内的功能。SmCYP98A14（HQ316179）开放阅读框（ORF）包含1 527 bp ，编码 508 个氨基酸。其在根中表达量最高，叶中次之，茎中极低。用脱落酸和茉莉酸甲酯处理丹参，发现SmCYP98A14的表达受 ABA 影响非常显著，在 2 h 时表达相对于空白提升了 40 倍，随后在 4 h下降到初始水平左右。同时SmCYP98A14受茉莉酸甲酯调控，2 h表达达到最大值，为对照的15 倍左右，从4 h 开始逐渐下降，于 12 h 降至初始水平，而后又有小幅上升。通过反义干扰和RNAi技术抑制 SmCYP98A14 的表达对丹参中酚酸类成分积累有明显的影响[9]。

3.8 NADH细胞色素P450还原酶酶基因（SmCPR）

SmCPR 是一类 NADPH细胞色素 P450 还原酶，它能够提高 SmCYP98A14 对底物的催化效率。SmCPR（FR693803）开放阅读框（ORF）2 118 bp，编码 705个氨基酸，其在根茎叶的表达较接近。 SmCPR 基因的表达受 ABA 影响，在 2 h 时表达相对对照提高 8倍，随后均在 4 h 下降到初始水平左右。SmCPR的表达受甲基茉莉酸调控，处理 2 h表达达到最大值（为初始表达的 20 倍左右），4 h 后逐渐下降，在 12 h 时降至初始水平，而后又有小幅上升[9]。

4 研究展望

为了提高品质、满足市场需求，利用基因工程、细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良以提高其药材有效成分的含量愈来愈受到人们的重视，许多基于毛状根培养、愈伤组织培养、细胞培养的方法被用于提高丹参中水溶性酚酸类物质的含量。目前，丹参功能基因组研究已经全面展开，丹参次生代谢骨架途径已经基本明了，随着分子生物学与基因工程技术的不断发展，利用整合分子生物学、转录组学、代谢组学等研究技术与手段，揭示代谢网络中能量利用和代谢流分配的规律，阐明丹参重要活性成分生物合成调控机制，使人们对丹参酚酸类成分的研究与认识越来越深入，并使得利用关键酶基因在模式微生物中进行异源表达来生产丹酚酸类成分成为可能。这将有效地解决丹参植物资源短缺的问题，并对于进一步高效开发利用丹参资源具有重要意义。

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