甘蓝型黑籽油菜遗传转化中预培养环节的优化

林呐　刘梅　丁凌

摘要 [目的]对甘蓝型黑籽油菜遗传转化中预培养环节进行优化。[方法]利用甘蓝型黑籽油菜下胚轴为外植体，对油菜下胚轴的预培养及其浸染后影响再生和分化情况进行研究，分别从苗龄、激素两方面讨论了下胚轴再生与分化频率的影响。[结果]苗龄、激素与遗传转化之间存在密切的联系。在农杆菌介导的油菜下胚轴预培养最佳体系是：4 d苗龄的外植体在农杆菌侵染前进行5 d预培养，预培养基是MS+2，4D 1.0 mg/L+ 6BA 4.0 mg/L。绿色抗性愈伤组织获得GUS瞬时表达，PCR鉴定再生植株为转基因植株。[结论] 该研究获得了最佳的预培养条件，为建立一个高效的遗传转化体系奠定基础。

关键词 甘蓝型油菜；遗传转化；预培养

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）20-06556-04

近几十年来，随着分子生物学和生物技术的飞速发展，遗传转化技术在培育油菜新品种中应用越来越广泛。而影响遗传转化技术的一个最重要的因素是再生体系的建立，只有建立了再生频率较高的再生体系才有可能在遗传转化体系上有所突破，建立高效的遗传转化体系与对再生体系的全面系统研究密切相关。

建立高效的油菜再生体系是运用农杆菌介导法进行油菜遗传转化的关键[1]。油菜转化效率具有极强的基因型依赖性[2]，且同一基因型不同外植体类型也有一定差异。因此，探讨黑籽油菜下胚轴再生体系的主要影响因子，并由此建立农杆菌介导的下胚轴高效遗传转化体系，对于广泛开展黑籽油菜的遗传转化具有重要意义。但遗传转化体系步骤很多，如预培养、共培养、筛选分化培养、生根培养等，要建立一个转化频率高的遗传转化体系需要做很多的工作，并优化改良每个步骤。笔者以甘蓝型黑籽油菜为试验材料，以下胚轴为起始外植体，对预培养中影响下胚轴再生体系及农杆菌侵染后的分化和再生能力主要因素（激素和苗龄）进行了探讨，并获得最佳的培养条件，为建立一个高效的遗传转化体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料。

甘蓝型油菜黑籽品种D2，为西南大学油菜工程研究中心提供。

1.1.2 菌种和质粒。

根癌农杆菌菌种是含pCNR的LBA4404，pCNR是个含卡拉霉素基因和GUS基因的双元载体。目的基因是从匍枝根霉中克隆获得的Δ6脂肪酸脱氢酶基因RnD6D（序列号：AY795076）[3]。

1.1.3 培养基。

①发芽培养基：MS（大量元素+微量元素+有机物+铁盐+3%蔗糖） ，pH 5.8；

②预培养基：A1：MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L 2，4D，A2：MS+4.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L 2，4D，

A3：MS+0.1 mg/L 6BA+1.5 mg/L 2，4D，pH 5.8；

③共培养基：MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L 2，4D + 0.2 mg/L AS，pH 5.8；

④分化培养基：MS+3.0 mg/L 6BA+0.1 mg/L 2，4D+100 mg/L Kan +400 mg/L Carb，pH 5.8。

1.2 试验方法

1.2.1 农杆菌浸染前的培养。选取籽粒饱满的油菜种子，75%乙醇浸泡30～60 s，无菌水冲洗2次；5%的次氯酸钠溶液浸泡15～18 min，无菌水冲洗5～6次，将种子接种于MS 固体培养基上，置培养室中26～28 ℃、光照16 h/d下萌发。分别取3、4、5 d龄无菌苗下胚轴作为外植体接入3种预培养基中，随机区组设计，共9个处理，每个处理接200个外植体。预培养1 d后记录下胚轴膨大个数，预培养3、5、7 d后分别记录愈伤并统计出愈率。出愈率（%）=（长出愈伤的外植体个数/外植体总数）×100。

1.2.2 农杆菌浸染及浸染后的培养。取出-80 ℃下保存的含有目的表达载体的农杆菌菌株，置摇床上200 r/min、28 ℃下培养过夜（16～20 h）进行预活化。取25～50 ml菌液接种于同样培养基中相同条件下培养至對数生长期。取对数生长期菌液室温下6 000 r/min离心搜集菌体，调OD600值为0.6～0.8，取3、4、5 d 龄的0.5～1.0 cm长的下胚轴，接入3种预培养基中预培养7 d，然后浸入农杆菌菌液感染20～30 min，其间不断振荡使菌液与外植体充分接触。用灭菌滤纸迅速吸干多余的菌液，将下胚轴平放在铺有一层灭菌滤纸的分化培养基上，黑暗中共培养2 d。共培养结束后，将外植体转入培养基中，于摇床上轻微振荡洗涤。取出外植体吸干多余液体，接入延迟筛选分化培养基中脱菌培养10 d后，分别记录、统计分化培养1、10 d的绿色外植体个数、黄色外植体个数、褐色外植体个数的百分比。

1.2.3 GUS染色检测。

将获得的抗性愈伤组织用GUS组织化学法测定。将待测定的材料，如愈伤组织或叶片，浸入适量XGluc溶液，于37 ℃保温过夜后，染色后用乙醇脱色直至脱掉叶绿素。在体视显微镜下观察，拍照记录。

XGluc染色液：0.2 mol/L Na3PO4缓冲液（62 ml 0.2 mol/L Na2HPO4；38 ml 0.2 mol/L NaH2PO4），pH 7.0；0.1 mol/L K3[Fe（CN）6]；0.1 mol/L K4[Fe（CN）6]·3H2O；1.0 mol/L Na2EDTA；0.1% XGluc。

1.2.4 再生植株PCR检测。

按CTAB法[4]从再生植株和非转基因对照植株的叶片组织中提取基因组DNA，进行PCR扩增。设计编码基因RnD6D区域的2条特异引物，用于基因组DNA扩增1.4 Kb的基因片段。RnD（6）D基因扩增的正向引物序列5ATGAGTACATTAGATCGTCAATCTAT3有26个碱基的寡核苷酸，反向引物序列5GAAAGATTTTATTTTATGCTTTCTAAAAGG 3有30个碱基的寡核苷酸。PCR的总体积是25 μl，包含有10 ng的模板DNA，2.5 μl 10× PCR缓冲液，1.5 μl 25 mmol/L MgCl2，0.5 μl 10 mmol/L dNTPs混合液，5 μmol/L正反引物各1 μl，0.25 μl Taq酶以及无菌水。PCR反应30个循环，94 ℃预变性2 min，循环包括94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min。0.8%琼脂糖胶电泳扩增DNA片段，紫外透射仪显像，数码相机拍照[3]。

2 结果与分析

2.1 激素、苗龄对下胚轴再生的影响 由表1可知，A2培养基在预培养7 d过程中，对不同苗龄下胚轴的影响前5 d的效果最好，而A1培养基对5 d苗龄下胚轴的出愈率效果最好，A3培养基在7 d的效果都不是很好。从培养基中6BA、2，4D的含量分析，2，4D的适宜浓度为1.0 mg/L。高于1.0 mg/L出愈率不好。在预培养初期6BA对出愈率的影响起主導作用，其浓度越高效果越好。但在预培养后期，2，4D起主要作用，高浓度的6BA对出愈率反而起抑制作用，这也是A3培养基在这7 d的效果都不是很好的原因。从苗龄的结果可以看出，3 d苗龄下胚轴的出愈率在预培养1、5、7 d时都表现出最好的效果，而4 d苗龄下胚轴的出愈率在预培养3 d时效果最好，5 d苗龄下胚轴的出愈率在预培养7 d表现效果都不好。3 d苗龄的下胚轴组织幼嫩，去分化能力强，因此表现出高的再生率，最高可达98.85%。5 d苗龄的下胚轴纤维化程度较深，去分化能力差，因此表现出低的再生率。4 d苗龄的下胚轴介于两者之间，在有限制条件（预培养3 d时）的情况下表现出高的再生率，最高可达83.42%。

方差分析表明，预培养1 d时，不同苗龄处理间对膨大的个数影响呈极显著差异；不同预培养基处理间对膨大的个数影响差异不显著。预培养3 d时，不同苗龄处理间对下胚轴的出愈率影响差异不显著。预培养5 d时，不同苗龄处理间对出愈率影响的差异呈显著水平。预培养7 d时，不同预培养基间和不同苗龄处理间对出愈率的影响效果均不显著。说明不同预培养基对不同苗龄外植体的影响随时间的延长差异并不明显，差异显著的主要在预培养5 d时，这与前人的研究结果一致。石淑稳等[5]研究表明，甘蓝型油菜4 d苗龄的子叶于培养基上预培养2或6 d后，再转到分化培养基上培养，不定芽再生率可提高34%～46%。王艳等[6]研究发现，带柄子叶预培养3 d可提高植株再生频率。

2.2 激素、苗龄对遗传转化的影响

共培养结束后1 d，分化培养10 d时分别统计绿色、黄色、褐色下胚轴的个数，并分别计算绿色、黄色、褐色下胚轴个数的百分比，并对这些数据进行方差分析，结果显示，预培养基间和苗龄间的差异都不显著。因此，分别计算每种预培养基在3、4、5 d苗龄时绿色、黄色、褐色下胚轴个数百分数的平均值；每个苗龄在A1、A2、A3培养基上预培养时绿色、黄色、褐色下胚轴个数百分数的平均值。并通过共培养1 d，分化培养10 d时绿色、黄色、褐色下胚轴个数百分数对比来分析预培养基、苗龄对遗传转化的影响。

绿色下胚轴表示下胚轴在农杆菌浸染后已经度过了危险期，能正常生长，发芽成苗的几率较大。褐色下胚轴表示下胚轴在农杆菌浸染后受到伤害，接近死亡。而黄色下胚轴表示其在农杆菌的胁迫下生长，处在最敏感最危险的时期，度过这一时期就会变成绿色，正常生长，分化成苗；而挺不过去就变为褐色，慢慢死亡（图1）。因此，分别对绿色、褐色、黄色下胚轴个数的百分比进行分析具有重要意义。

由图2可知，培养基影响下的绿色下胚轴所占比率的平均数均呈下降趋势；其中A2培养基下降的比率最小，A1培养基下降的比率最大，A3培养基介于两者之间，表明A2培养基生成绿色愈伤的效果最好。

由图3可知，苗龄影响下的绿色下胚轴所占比率的平均数均呈下降趋势。其中4 d苗龄的下胚轴作为外植体时下降

注：A.绿色下胚轴；B.黄色下胚轴；C.褐色下胚轴。

图1 农杆菌侵染后培养10 d的下胚轴

图2 培养基对绿色下胚轴的影响

的比率最小，5 d苗龄的下胚轴作为外植体时下降的比率最大，3 d苗龄介于两者之间。表明4 d苗龄的下胚轴作为外植体时，生成绿色愈伤的效果最好。

图3 苗龄对绿色下胚轴的影响

由图4可知，培养基影响下的黄色下胚轴所占比率的平均数A2培养基呈下降趋势；A1和A3培养基呈上升趋势；其中A3培养基的上升趋势表现更为明显，表明A2培养基受农杆菌胁迫最小。

图4 培养基对黄色下胚轴的影响

由图5可知，苗龄影响下的黄色下胚轴所占比率的平均数3、4 d苗龄的下胚轴作为外植体时均呈下降趋势；5 d苗龄的下胚轴作为外植体时呈上升趋势，表明3、4 d苗龄的下胚轴变成黄色的趋势在下降，其中4 d苗龄下降明显。

图5 苗龄对黄色下胚轴的影响

由图6可知，培养基影响下的褐色下胚轴所占比率的平均数均呈上升趋势；A1培养基上升趋势最为明显；A2培养基的上升趋势最小，表明A2培养基抵御褐化的能力最强。

图6 培养基对褐色下胚轴的影响

由图7可知，苗龄影响下的褐色下胚轴所占比率的平均数均呈上升趋势；其中4 d苗龄的下胚轴作为外植体时上升趋势不明显，表明4 d苗龄的下胚轴抵御褐化的能力最强。

图7 苗龄对褐色下胚轴的影响

综合农杆菌浸染前后对下胚轴膨大、生长愈伤、颜色变化情况，A2培养基无论是对出愈率的影响，还是在抵制农杆菌浸染的效果方面都表现最好。说明愈伤组织的生长与农杆菌浸染之间存在密切的联系。高的出愈率能更好地抵制农杆菌的浸染。3 d苗龄的下胚轴虽然出愈率高，但在农杆菌浸染后生长没有4 d苗龄的下胚轴好。这主要是因为3 d苗龄的下胚轴组织幼嫩，在农杆菌浸染时易受到伤害，褐化死亡；也说明过多的愈伤组织并不利于浸染。而4 d苗龄的下胚轴组织既不太幼嫩，纤维化程度也不强，再生能力高，抵御农杆菌胁迫的能力强，因此，4 d苗龄的下胚轴作为遗传转化中预培养的外植体最好。一般认为，愈伤组织的质地对幼苗分化具有重要意义[7]，因而获得的愈伤组织是否是抗性愈伤组织也决定了是否获得转基因植株。经GUS染色证实获得的愈伤组织得到瞬时表达（图8）。其再生的植株经PCR检测发现（图9）表现阳性，初步说明目的基因整合到油菜植株基因组中[8]，这样获得的植株是转基因植株。

图8 抗性愈伤组织GUS基因表达

注：1： DNA标记；2：质粒的 PCR 产物 （阳性对照）；5， 7，12，13： 非转化植株的PCR 产物 （阴性对照）；3，4，6，8～11： Kan抗性植株的PCR 产物。

图9 再生植株中RnD6D基因的PCR检测

3 讨论

3.1 激素对再生（出愈率）与遗传转化的影响

以下胚轴为外植体进行遗传转化，操作过程简单，下胚轴再生能力强，遗传转化率高，是遗传转化的理想材料。一般认为下胚轴愈伤组织诱导必须在培养基中添加2，4D和6BA，因2，4D能提高内源ABA的水平，能提高愈伤分化率、质量和时间。甘蓝型油菜下胚轴在被农杆菌感染期间用低浓度的2，4D培养基进行短时间預培养，能提高转化率[9]。陆万香等[10]研究表明，适当浓度的2，4D（0.8～1.0 mg/L）对下胚轴进行3 d左右的启动分化，可明显提高抗性芽率（6.3%）；2，4D浓度高于1.2 mg/L或预培养时间超过4 d外植体都会稀软、黄化，耐感染能力显著降低；2，4D浓度低于0.8 mg/L或预培养时间少于2 d时下胚轴分化不明显，感染后迅速褐化、死亡。赵云等[11]比较2，4D、IAA、ZT、6BA的浓度对不同基因型甘蓝型油菜下胚轴愈伤组织分化的影响，结果表明，以2，4D浓度1 mg/L和6BA浓度2 mg/L的MS培养基最优，84%以上外植体长出愈伤组织，其中34%长出芽点。该研究结果也得出了类似的结论，即2，4D浓度为1.0 mg/L时，下胚轴的再生能力和分化能力最强。2，4D是植物组织培养中最常见的愈伤组织诱导剂，能有效地诱导植物细胞的脱分化，其浓度对愈伤组织的数量和质量均有较大影响。2，4D属于生长素类物质，低浓度对生长起促进作用，高浓度则起抑制作用，1 mg/L对诱导油菜下胚轴的愈伤为最适宜浓度。同时，研究发现6BA浓度4 mg/L时，效果较好，与前人的研究结果有一定差异，这可能与试验设计有关。试验设计时共培养时间没有作梯度设计，而是直接培养2 d后进行分化培养，因而2，4D培养时间、浓度差异不大，6BA成为愈伤组织变化的主要因素。综上所述，外植体的再生频率与遗传转化的效果之间具有密切联系。激素影响再生频率，也间接和直接影响遗传转化。

3.2 苗龄对再生（出愈率）与遗传转化的影响

苗龄是影响外植体生理状态的重要因素。许本波等[12]研究认为，苗龄越大，下胚轴会变得细弱，不利于芽的分化；苗龄越小，下胚轴过嫩，切割外植体时易损伤表皮导致失水严重，下胚轴易死亡，再生培养出芽率很低；因而苗龄恰当，下胚轴粗壮，有利于获得较高的出芽率。该研究结果表明，3 d苗龄下胚轴的再生能力很强，出愈率最高，这和王艳等[13]研究结果一致。石淑稳等[14]研究也表明，外植体采用预培养，苗龄在7 d以上是不适宜的。但4 d苗龄下胚轴的出愈率仅次于3 d苗龄下胚轴的出愈率，其下胚轴农杆菌浸染后遗传转化效果最好。这与前人结论不同，说明过多的愈伤组织并不利于浸染。3 d苗龄下胚轴的愈伤生长速度最快，但长出的愈伤抵御农杆菌伤害的能力差，农杆菌浸染后易褐化死亡。而4 d苗龄下胚轴的愈伤生长速度达到对数增长的旺盛时期，其抵御农杆菌伤害的能力强，农杆菌浸染后能很快适应不利的外界环境条件正常生长。该研究结果也表明其长出的愈伤更利于成为抗性愈伤（图8）。