克百威和毒死蜱农药降解菌的驯化与筛选

王新　刘丽　吴贺军等

摘要 [目的]筛选对克百威和毒死蜱的优势降解菌。[方法]选取克百威和毒死蜱2种农药作为降解对象，通过分别对特定水样中微生物进行驯化、分离、纯化等处理后，各获得多株细菌和真菌；以2种农药分别作为唯一碳源，测定各菌株5 d内的化学需氧量（COD）值，通过COD去除率筛选出克百威和毒死蜱的优势降解菌。[结果]在可降解克百威的细菌LLBK1～10组中LLBK2、LLBK6和LLBK7的COD去除率较高，分别为93.83%、93.21%和93.83%，3株菌种均为革兰氏阴性菌；在可降解克百威的真菌LLFK1～3组中LLFK1和LLFK2的COD去除率较高，分别为77.16%和79.01%；同时可降解毒死蜱的细菌LLBD1～8组中LLBD1、 LLBD3和LLBD4的COD去除率较高，分别为57.69%、59.23%和56.92%，3株菌种同样均为革兰氏阴性菌；在可降解毒死蜱的真菌LLFD1～3组中LLFD1、LLFD3的COD去除率较高，分别为61.54%和59.23%。[结论]为克百威和毒死蜱的降解研究提供了参考。

关键词 克百威；毒死蜱；驯化；筛选；COD去除率

中图分类号 S482；X172 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）20-06699-04

Acclimation and Screening of Degradable Microorganisms of Carbofuran and Chlorpyrifos

WANG Xin et al

（Shen Yang University of Technology， Shenyang， Liaoning 110870）

Abstract [Objective] The aim was to screen degradable microorganisms of Carbofuran and Chlorpyrifos. [Method] Carbofuran and Chlorpyrifos were chosen as degrading objects. By acclimation of microorganisms in the water， the bacteria that could degrade Carbofuran and Chlorpyrifos were obtained. After plate separation and purification， screening bacteria could be obtained. Several fungi and bacteria with higher degradation ability were obtained in the experiment， compared with their degrading capability， via COD removal efficiency under the condition of the pesticides as the sole carbon source in five days. [Result] In the group of LLBK110， the COD removal rates of gramnegative bacteria LLBK2， LLBK6 and LLBK7 were higher， up to 93.83%， 93.21% and 93.83%， respectively； in the group of LLFK13， the COD removal rate of LLFK1 and LLFK2 were higher， up to 77.16% and 79.01%， respectively； in the group of LLBD18， the COD removal rates of gramnegative bacteria LLBD1， LLBD3 and LLBD4 were higher， up to 57.69%， 59.23% and 56.92%， respectively； in the group of LLFD13， the COD removal rates of LLFD1 and LLFD3 were higher， up to 61.54% and 59.23%， respectively. [Conclusion] The results provide reference for study on degradation of Carbofuran and Chlorpyrifos.

Key words Carbofuran； Chlorpyrifos； Acclimation； Screening； COD removal rate

克百威與毒死蜱是农田中较常使用的2种农药。克百威（Carbofuran），别名呋喃丹，化学名称为2，3二氢2，2二甲基7苯并呋喃-甲基氨基甲酸酯，属氨基甲酸酯类农药[1]，1967年由美国FMC公司首次合成，1968年注册使用[2]。克百威作为一种高效广谱的杀虫剂极难降解，在旱地土壤中的半衰期一般为30～60 d，其长时间的残留对土壤及地下水都会造成不同程度的污染[3]。近年来国内外关于克百威降解的研究报道逐年增多[4-8]。

毒死蜱（Chlorpyrifos），化学名称为O，O二乙基O（3，5，6三氯2吡啶基）硫代磷酸酯，是由美国陶氏益农公司于1964年研制出的一种高效、广谱、中等毒性的有机磷杀虫、杀螨剂。毒死蜱作为代替高毒有机磷类农药的主要有机农药品种，在我国的应用日益广泛，危害也在逐步扩大[9]。其在土壤中的半衰期受本身浓度、土壤酸碱度、微生物活动状况等各种因素影响，在不同条件下半衰期从几天到几百天不等。现今已有很多研究人员将目光转移到毒死蜱农药的降解问题上[10-14]。

为此，笔者采用微生物法，以克百威和毒死蜱为降解对象，选取原沈阳东北制药厂厂区内土壤为试验土样，经过驯化、筛选等步骤筛选出分别对2种农药有一定降解作用的菌种，并通过各菌株的COD去除率确定了降解效果较好的几株菌株，以期为克百威和毒死蜱的降解研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药剂。克百威：江苏镇江建苏农药化工有限公司生产；毒死蜱：山东荣邦化工有限公司生产；细菌培养基：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠；真菌培养基：鲜土豆、葡萄糖；COD试剂：意大利哈纳。

1.1.2 仪器。

LXLC50型立式自动电热压力蒸汽灭菌器，安徽合肥华泰医疗设备有限公司；HZQA型数显恒温摇床，江苏苏州威尔实验用品有限公司；BPX52数显电热恒温培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；微电脑化学需氧量测定仪，意大利哈纳。

1.2 方法

1.2.1 菌种的驯化。

将取自原沈阳东北制药厂厂区内的土样（分为湿土和干土）加入蒸馏水振荡2 h后，各取2份150 ml的上清液于锥形瓶中，标为干样1、干样2和湿样1、湿样2。向2种样1中加入毒死蜱，其浓度为16 mg/L，向2种样2中加入克百威，其浓度为20 mg/L。将4个锥形瓶放入同一恒温摇床中振荡，温度为35 ℃，转速为110 r/min，培养周期为48 h。

水样中进行的菌种驯化需要连续几个周期，每次转接时取上一周期水样15 ml加入另一锥形瓶中，向其中分别加入2種农药适量，再加入蒸馏水至150 ml，然后放入恒温摇床振荡。在转接过程中应适当增加2种农药的浓度（表1）。

1.2.2 菌种的分离。

采用平板划线法。向溶解的固体细菌培养基和固体真菌培养基中分别加入克百威和毒死蜱，其浓度分别为20、16 mg/L，并做好标记，于高压灭菌器中灭菌30 min。

灭菌后迅速将各仪器和培养基转入无菌室内，将已融化并冷却至50 ℃左右的固体培养基分别倒入培养皿中，并在培养皿盖上做好标记。待培养基凝固后，用接种环分别挑取1环驯化好的水样，在对应的培养基上划线，每个样品平行5个。待全部划线完成后，将所有培养皿倒置于37 ℃恒温培养箱中培养48 h。培养后部分长势较好的单个菌落见图1。

图1 培养基上长势较好的单个菌落

1.2.3 菌种的纯化。

采用平板划线法。将在培养基上长势较好的可分别降解克百威、毒死蜱的细菌菌落和真菌菌落转接至对应的、农药浓度提高了10%的新培养基上，之后倒置放入恒温培养箱中继续培养48 h。上述农药浓度提升的转接进行3次。

完成菌种纯化后，在其中选取长势良好的菌落转接至对应的斜面培养基保存。最后确定10株可降解克百威的细菌（标记为LLBK1～10）、3株可降解克百威的真菌（标记为LLFK1～3）、8株可降解毒死蜱的细菌（标记为LLBD1～8）和3株可降解毒死蜱的真菌（标记为LLFD1～3）。

1.2.4 菌株的筛选。

为得到对克百威和毒死蜱具有较高降解效率的菌株，菌株纯化后需对其进行筛选。采用测定COD的方法，即通过比较各菌株的COD去除率来确定菌株降解农药的能力，从而筛选出优势菌株。

1.2.5 分析方法。

在2种农药作为唯一碳源的条件下对各菌株进行5 d的COD值测定，通过与对照组COD数据值的比较来判断各菌株是否起到降解农药的作用，通过比较各菌株最终的COD去除率筛选出降解2种农药效果最好的优势菌。

数据统计采用SPSS 13.0软件，运用Duncan′s新夏极差法检验各菌株COD去除率差异显著性。

2 结果与分析

2.1 可降解克百威的细菌的COD测定结果

由图2可知，唯一碳源条件下可降解克百威的10株细菌在5 d的COD测定过程中表现出不同的下降趋势。首先，10株细菌在第1天内的COD下降趋势最明显，随后几天COD下降值变化则较平缓。从对照组的5 d COD测定数据可以看出，即使不加入菌株其COD值也会由于其他原因而减小，但加入菌株的克百威水样中COD值明显小于对照组，说明加入的各菌株起到降解克百威的作用。

2.2 可降解克百威的真菌的COD测定结果

在唯一碳源的条件下可降解克百威的3株真菌在5 d的COD测定过程表现出COD下降趋势（图4）。3株真菌在第1天的COD下降趋势最明显，且在每一次的数据测定中加入了菌株的克百威水样的COD值均明显小于对照组，说明加入的真菌菌株起到降解克百威的作用。

2.3 可降解毒死蜱的细菌的COD测定结果

由图6可知，8株细菌在5 d的COD测定过程中同样表现出不同的COD下降趋势。各株细菌在第1天的COD下降趋势都不是最明显，并且整个测定期间内总体的COD变化都较平缓。将对照组的5 d COD测定数据同加入了菌株的水样的COD测定值相比，各阶段的对照组数据都要大于加入了菌株的水样组数据，表明加入的菌株起到降解毒死蜱的作用。

2.4 可降解毒死蜱的真菌的COD测定结果

由图8可知，在5 d的测定期间3株真菌的COD下降趋势各不相同，各菌株的COD降低量在5 d内差值并不大。将加入菌株的水样的COD测定值同对照组的COD测定数据相比后可以看出，加入的各菌株起到降解农药毒死蜱的作用。

3 结论

通过驯化和筛选得到对克百威和毒死蜱具有一定降解作用的多株菌株。在克百威作为唯一碳源的条件下，经过对各菌株COD去除率的比较，在可降解克百威的细菌组中筛选出3株菌种的COD去除率较高，即为对克百威的降解效率较高，它们分别为LLBK2、LLBK6和LLBK7号菌株，其COD去除率分别为93.83%、93.21%和93.83%；在可降解克百威的真菌组中筛选出2株菌种的COD去除率较高，分别为LLFK1和LLFK2号菌株，COD去除率分别为77.16%和79.01%。在毒死蜱作为唯一碳源的条件下，从可降解毒死蜱的细菌组中筛选出3株菌种的COD去除率较高，它们分别为LLBD1、LLBD3和LLBD4号菌株，其COD去除率分别为57.69%、59.23%和56.92%。在可降解毒死蜱的真菌组中筛选出2株菌种的COD去除率较高，分别为LLFD1、LLFD3号菌株，其COD去除率分别为61.54%和59.23%。

各株细菌经过革兰氏染色后，确定均为革兰氏阴性菌，同时可降解毒死蜱的3株细菌亦均为球菌。

参考文献

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