环境中产铁载体真菌的筛选

郭健　董媛　朱洁　李艳

【摘 要】铁载体是由细菌和真菌代谢产生的小分子化合物，在生物医药上有着越来越重要的应用价值。本实验室通过CAS法对分离自云南境内的锡尾矿、湖泊以及盐矿中的58株真菌进行逐步筛选，得到4株铁载体产生菌，经初步鉴定，该4菌均为曲霉属真菌，证明该属真菌有着较广泛代谢产铁载体的特点，为铁载体产生菌的后续研究提供依据。

【关键词】铁载体 真菌 CAS 筛选

【Abstract】Siderophores are small molecular compounds produced by bacteria and fungi， which have more and more important application value. Through the CAS method，we screened from 58 strains of fungi isolated from the tin mine tailings ，the salt mine and the lake in Yunnan Province. Finally 4 strains of siderophore-producing fungi were got and all of them were Aspergillus. The result proved that these fungi had extensive metabolic characteristics of siderophore-producing， which provided the basis for the following studies.

【Keywords】Siderophore； fungi；CAS；screening

铁载体（Siderophores）是一种铁的鏊合剂， 在铁缺乏的环境下铁依赖性生物体自身分泌的小分子量化合物（小于1500Da），起到吸收和运输铁的作用[1]。铁载体对高铁离子有高亲和力，结合常数为1025-1052，可以从宿主体内铁结合蛋白上摄取铁[2]。不同的真菌或细菌产生特定结构的铁载体[3]。铁载体对高铁离子的较强亲和力使得其在生物医药上有越来越重要的应用[4]，例如：地中海贫血病是一种典型的铁过载疾病。红酵母酸是一种真菌铁载体， 它可以作为药物促进对铁代谢从而达到治疗效果[5]。

本实验室通过对58株真菌（分离自云南个旧大屯锡尾矿，云南程海湖和昆明盐矿）利用CAS法进行检测，筛选铁载体产生菌。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-50KB，上海申安医疗器械厂）；电热培养箱 （PHX-9272 MBE， 上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；摇床 （SUKUN SKY-2102 ， 上海苏坤电器有限公司）。

1.1.2 试剂

CAS-HDTMA溶液（Schwyn B，Neilands B，1987）：A液：60.5mg铬天青（CAS）溶解与50ml去离子水。加入10ml Fe3+ 溶液（1mM FeCl3﹒6H2O，10Mm HCl），搅拌溶解；B液：72.9mg十六烷基三甲基溴化胺（HDTMA），40ml水，搅拌溶解；A液缓慢与B液混合，115℃灭菌20min。

MM9：KH2PO43g，NaCl 5g，NH4Cl 10g，双蒸水1000ml。

CAS固体培养基：去离子水750ml，NaOH6.0g，PIPES 30.24g，MM9100ml，琼脂20g，PH7.4-7.8。115℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃，加入100ml已灭菌的CAS-HDTMA溶液，混匀后倒入平皿。

水解酪蛋白-葡萄糖培养基：水解酪蛋白0.5%，葡萄糖2%，琼脂2%。121℃灭菌30min。

PDA液体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1L。

促孢培养基（改良的Joffe）：KH2PO41g，KNO31g，MgSO4﹒7H2O 0.5g，KCl 0.5g，淀粉0.2g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，琼脂 20g，水1000ml，pH自然。

培养基在114℃下灭菌10min，放置培养箱内，30℃下培养24h，再以相同条件灭菌一次。

1.2 实验方法

1.2.1 固体发酵

将CAS固体培养基倒入平皿中，厚度约3mm。待其冷却凝固后，再倒入2mm厚度的水解酪蛋白-葡萄糖培养基，构成了复式培养基。将58株菌以穿刺接种的方式接种于两层培养基之间。30℃下恒温培养。以EDTA作为对照。

1.2.2 液体发酵

将菌株接种于100ml PDA液体培养基中，28℃下摇床培养3d。过滤取上清液，以CAS-HDTMA溶液：上清液=1：2的体积滴加加于试管内，充分摇晃后，静止30min。观察试管内颜色变化。

1.2.3 电镜下观察菌株形态

将菌株用促孢培养基进行埋片（埋盖玻片）培养，30℃下恒温培养箱内培养3-5d。收集带有菌丝体的盖玻片，晾干48h，待观察。

2 结果与讨论

2.1 固体培养基筛选结果

菌体在复式培养基上生长48h后，产铁载体真菌的菌丝体周围出现橙色晕圈，如图1所示。

2.2 发酵液检测结果

发酵上清液与CAS-HDTMA检测液反应，产铁载体菌的发酵液加检测液后变红。如图2所示。

经检测，有4株真菌在固体培养基上和发酵液检测后均有明显的颜色变化，因此4株真菌皆为铁载体产生菌。

2.3 产铁载体真菌电镜下的形态（如图3所示）

固体培养基上观察到各个菌株生长速度较快。电镜下观察到丰富的菌丝和大量孢子。初步判断以上4株菌株均为曲霉属（Aspergillus）菌株。

3 结语

经过对分离自云南自然环境中的58株真菌的检测筛选，得出4株曲霉属产铁载体真菌。证明该属真菌有着较广泛代谢产铁载体的特点，为铁载体产生菌的后续研究提供依据。

参考文献

[1]Winkelmann G. Importance of siderophores in fungal growth， sporulation and spore germination. In Frontiers in Mycology， CAB International， Wallingford. 1991 （D. L.Hawksworth， ed.）： 49-65.

[2]Neilands JB. Microbial iron compounds [J]. Annu Rev Biochem， 1981，50（1）：715-731.

[3]Haselwandter K. Structure and function of siderophores producedby mycorrhizal fungi[J]. Mineral Mag，2008，72（1）：61-64.

[4]Day JP， Krill P. The chemistry of desferrioxamine chelation for aluminium overload in renal dialysis patients[J]. Therc Drug Monit， 1993， 15（6）： 598-601.

[5]Faa G， Crisponi G. Iron chelating agents in clinical practice[J]. Coord Chem Rev， 1999， 184（1）：291-310.