麻栗坡兜兰ISSR引物筛选及反应体系的优化

高丽霞

摘要 [目的] 对麻栗坡兜兰ISSR引物进行筛选，并建立一个稳定性高、重现性好、适合麻栗坡兜兰ISSR反应体系。[方法]以麻栗坡兜兰DNA为模板，分别对Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、DNA等PCR反應成分进行优化，并用优化的体系对25条兰科中报道的ISSR引物进行筛选。[结果]确立了麻栗坡兜兰最适ISSR-PCR反应体系：在25 μl反应体系中，Mg2+ 2 mmol/L、引物0.4 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、DNA 1.5 μl、Taq酶1.4 U。利用该体系，共筛选得到10条ISSR引物用于麻栗坡兜兰分析，并对21份麻栗坡兜兰材料进行扩增，获得了较好的扩增效果。[结论]该体系稳定可靠，为今后ISSR标记在兜兰属植物的种质鉴定、遗传多样性等方面的广泛应用奠定了重要基础。

关键词 麻栗坡兜兰；ISSR-PCR；体系优化

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）20-06553-03

麻栗坡兜兰（Paphiopedilum malipoense）属兰科（Orchidaceae）兜兰属（Paphiopedilum）地生兰或半附生兰。麻栗坡兜兰是兜兰属现存种类中最原始的类型，代表了由杓兰属向兜兰属过渡的种类[1]，主要分布于云南东南部、广西西部、贵州西北部，以及越南北部。一方面由于近年来的过渡采摘，另一方面由于其自身的生物学原因，它没有像硬叶兜兰和杏黄兜兰那样延长的地下根状茎[2]，是当前最需要保护的濒临物种之一。

ISSR分子标记技术已在兰科中得以广泛应用。赵谦等[3]用14条ISSR引物分析了14个蝴蝶兰品种间的遗传关系，其多态百分比为82%，表明蝴蝶兰品种间存在丰富的遗传多样性，并构建了ISSR遗传图谱；吴振兴等[4]用15条ISSR引物对兰属植物进行遗传多样性分析，其多态百分比为27.2%，并构建了ISSR遗传图谱；孙小琴等[5]用12条ISSR引物对江西省寒兰进行了遗传多样性分析，其多态百分比为78.9%；马佳梅等[6]用12条ISSR引物对西双版纳地区流苏石斛进行遗传多样性分析，其多态百分比为89.74%，表明流苏石斛品种间存在丰富的遗传多样性；严华等[7]采用ISSR分子标记技术对38种国兰亲缘关系进行分析；沈颖等[8]用ISSR分子标记技术对9种石斛属植物进行品种鉴定分析。但在兜兰属的研究中，仅见陈业等[9]对兜兰属亲缘关系的分析，从50条引物中，仅筛选得到6条，对分析遗传多样性远远不够。

笔者以我国濒临物种麻栗坡兜兰为材料，对影响ISSR扩增效果的dNTP、Mg2+、引物、Taq酶以及模板DNA进行单因子优化试验，建立适用于麻栗坡兜兰的ISSRPCR反应体系，利用该体系对从兰科中检索到的25条ISSR引物进行筛选，为进一步研究麻栗坡兜兰遗传多样性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为麻栗坡兜兰，采自木论国家级自然保护区的自然居群。

1.2 试验方法

1.2.1

DNA的提取。取新鲜带叶兜兰的嫩叶，经研磨后，按MURRAY等[10]的CTAB法提取叶片总DNA[10]。

1.2.2

ISSR分析。

ISSR引物由上海生工生物工程有限公司合成，参照高丽等[11]，吴振兴等[4]，严华等[7]以及沈颖等[8]的研究结果选取其中的25条引物进行试验，编号分别为UBC807，UBC811，UBC812，UBC814，UBC817，UBC818，UBC820，UBC822，UBC825，UBC827，UBC829，UBC834，UBC835，UBC836，UBC840，UBC841，UBC855，UBC860，UBC862，UBC864，UBC867，UBC868，UBC880，UBC881，UBC895。

设定原始反应体系为：25 μl反应体系中10×PCR Buffer 2.5 μl、dNTP 0.2 mmol/L、Mg2+3 mmol/L、引物0.4 mmol/L、Taq酶1.4 U、模板DNA 30 ng。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，49 ℃复性40 s，72 ℃延伸90 s，40个循环。最后72 ℃延伸7 min，然后置于4 ℃保存。扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶，170 V电压电泳检测，选取扩增条带清晰、多态性好的引物进行下一步优化试验。

1.2.3

ISSRPCR试验设计。采用单因素试验设计方法，对ISSR反应体系中的Mg2+、引物、Taq酶、模板DNA、dNTP 5种主要成分进行分析（25 μl反应体系中各成分优化设计方案见表1）。

1.2.4

引物筛选。取麻栗坡兜兰DNA样品用优化后的反应体系对25条引物进行筛选，选出扩增条带清晰、多态性好的引物。

1.2.5

ISSRPCR体系的验证。利用优化后的最佳反应体系，用筛选的引物对21份麻栗坡兜兰进行ISSRPCR扩增，检测ISSRPCR扩增效率及体系稳定性。

2 结果与分析

2.1 初次引物筛选结果

将25条引物进行初步筛选，引物UBC840扩增条带较理想，因此选择UBC840进行ISSRPCR反应体系的优化。

2.2 各单因素对扩增结果的影响

2.2.1

引物浓度。由图1可知，引物浓度在0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L时都有扩增，浓度为0.1和0.2 mmol/L时没有扩增条带。 引物浓度过低时PCR产率会大大降低，甚至不能扩增；引物浓度过高时PCR所扩增的条带变得模糊，还会产生新的位点，非特异性扩增增加。因此，引物浓度为0.3 mmol/L时扩增效果最好。

注：1～8是引物浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L；9～16是dNTP浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mmol/L。

图1 不同引物浓度、dNTP浓度的ISSRPCR扩增结果

2.2.2

dNTP浓度。dNTP是PCR扩增反应中磷酸基团的主要原料，其浓度对PCR反应具有至关重要的影响，对dNTP 8个不同浓度进行了扩增，结果见图1。由图1可知，8个浓度均能扩增条带，当dNTP浓度为0.15 mmol/L时扩增条带最清晰，效果最好。

2.2.3

Mg2+浓度。Mg2+与dNTP以及模板DNA结合形成复合体，才能被Taq酶识别，其浓度影响Taq酶的活性、精度及产物的特异性，还可影响模板与PCR产物的解链温度，引物二聚体的形成等。由图2可知，8个不同浓度的Mg2+，除浓度1.0 mmol/L没有扩增条带外，其他浓度均能扩增条带。浓度为1.5 mmol/L时只有2条扩增条带，浓度高于2.0 mmol/L时，大片段的非特异性扩增带增多，因此确定2.0 mmol/L为Mg2+的最佳浓度。

注：1～8 Mg2+浓度分别为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 mmol/L。

图2 不同Mg2+浓度的ISSRPCR扩增结果

2.2.4

模板DNA。

模板DNA也是影响ISSRPCR反应的因素之一，模板DNA的用量分别为10、20、30、40、50、60、70、80 ng，其每个梯度都有扩增，结果见图3。由图3可知，当DNA用量为30 ng时扩增效果较好。

注：1～8是Taq酶用量分别为0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2U；9～16是DNA用量分别为10、20、30、40、50、60、70、80 ng。

图3 不同Taq酶用量、DNA用量的ISSRPCR扩增结果

2.2.5

TaqDNA聚合酶。Taq酶通过降低反应的活化能加快反应速度，不改变反应的平衡点。其用量在PCR反应中也是一个重要的因素，用量过低则不能扩增，用量过高又会产生非特异性扩增且增加成本。试验设计了0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 U 8个梯度，扩增结果见图3。由图3可知，在所设梯度中，扩增差异不显著，因此选0.8 U。

2.3 麻栗坡兜兰ISSRPCR最佳反应体系

最终确定木论麻栗坡兜兰ISSRPCR的最佳反应体系为：25 μl体系中含有引物0.3 mmom/L、dNTP0.15 mmol/L、Mg2+2 mmol/L、模板DNA 30 ng、Taq酶0.8 U、10×PCR Buffer 2.5 μl。

2.4 引物筛选结果

按优化后的ISSRPCR最佳反应体系对引物进行筛选，结果从25条引物中筛选出10条有扩增条带的引物，其中，引物UBC834、UBC835、UBC840扩增条带最清晰，重复性最好；其次是引物UBC812、UBC822、UBC841、UBC868、UBC880、UBC881；引物UBC855只有微弱的扩增（图4）。

2.5 优化体系的验证

利用優化出来的体系和筛选出来的引物用于木论麻栗坡兜兰ISSRPCR反应，验证该体系的实用性。选取UBC840和随机选取21份材料进行PCR扩增，扩增结果见图5。由图5可知，该体系在各材料中具有较清晰的条带，且具有丰富的多态性。

3 结论与讨论

DNA模板用量一般对扩增结果影响不大，试验中，ISSR反应对模板DNA的用量要求不是特别严格，每个反应梯度都有较好的扩增结果；而适合的引物浓度对PCR产率及多态性扩增都有关键性的影响，该试验过低的引物浓度（0.1、0.2 mmol/L）没有得到扩增产物，过高的引物浓度（0.7、0.8 mmol/L）扩增产物不清晰，效率低；Mg2+浓度影响反应的特异性和扩增效率，其浓度对反应影响较大，该研究也证明了这一点，当浓度低于2 mmol/L时，几乎没有扩增结果；相对于反应体系中其他成分而言，Taq DNA聚合酶的用量直接决定试验的稳定性与重现性，高浓度Taq DNA聚合酶增加成本和非特异性扩增产物，低浓度的酶可能使催化能力不够强而影响产物的合成效率，因此选择高质量的酶是试验开展的首要任务，其合适的用量也是关键。

该试验通过对影响ISSRPCR反应的多个因素的系列调整与优化，建立了适合麻栗坡兜兰ISSR分析的PCR反应体系，并将这一体系用于21份木论麻栗坡兜兰进行体系验证，结果证明该体系稳定可靠，该体系的成功建立为今后ISSR标记在兜兰属植物的种植鉴定、遗传多样性等方面的广泛应用奠定了重要基础。

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责任编辑 李占东 责任校对 况玲玲