利用玉米萌动胚获得抗除草剂转基因新材料

仲义+王云鹏+代秀云+刘文国

摘要：从甲磺隆抗性结缕草植株中克隆得到乙酰乳酸合成酶基因（ALS），构建35S启动子驱动的该基因的植物表达载体p33-ALS。用农杆菌介导的玉米萌动胚转化方法转化玉米种子，获得抗除草剂的转ALS基因玉米材料。结果表明，经除草剂筛选共获得抗性植株7株，阳性率为1.4%，T1代植株除草剂抗性试验表明，转基因植株能够耐受住5%的甲磺隆溶液喷洒。分离得到的ALS基因导入玉米基因组后能够极大地提高对甲磺隆的耐受能力。

关键词：玉米；萌动胚；农杆菌；遗传转化

中图分类号：S513；Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4001-04

Generating Herbicide Resistant Transgenic Plants in Maize with

Germinating Embryo as Explants

ZHONG Yi1， WANG Yun-peng2， DAI Xiu-yun1， LIU Wen-guo2

（1. Maize Research Institute， Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， Jilin， China； 2. College of Agriculture， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）

Abstract： The plant expression vector p33-ALS driven by 35S promoter was constructed from the resistance of a short cycling zoysia plants originated from cloning ALS gene. The genetically modified maize with herbicide resistance ALS gene was obtained with agrobacterium mediated transformation of stirring of maize embryo into maize seeds. The results showed that the positive rate of the resistant 7 plants filtrated by way of herbicide was 1.4%. Herbicide resistance of the T1 generation plant showed that the transgenic plants tolerated a solution spray with 5% metsulfuron-methyl. The ALS gene isolated from this study after transferred into maize genome can greatly improve maize tolerance of metsulfuron-methyl.

Key words： maize； germinating embryo； agrobacterium tumefaciens； genetic transformation

杂草是危害农作物的主要生物胁迫之一，尽管其对玉米生长中后期不再产生影响，但早期仍需要进行除草。除草剂是玉米除草十分理想的选择，尽管已有玉米专用性除草剂出现，但是对于多数单子叶杂草，其效果仍不理想，并且与草丁膦抗性相关的bar基因、与草甘膦抗性的EPSPS基因等许多除草剂基因均已被国外育种公司注册并取得了专利保护，成为我国育种过程中进一步应用的障碍。乙酰乳酸合成酶（ALS）是植物和微生物中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸合成途径的第一种酶，不同的ALS的氨基酸序列的差异与磺酰脲类除草剂抗性具有很大的关系，多数植物的ALS对磺酰脲类除草剂较为敏感，目前已在拟南芥、细菌等中对此基因进行了克隆并对氨基酸序列和除草剂抗性的关系进行了研究[1，2]，但相关的专利保护不像bar基因、EPSPS基因那样苛刻。

利用农杆菌侵染及基因枪轰击等方法对玉米不同来源的外植体，诸如悬浮细胞[3]、幼胚[4]、幼穗[5，6]、茎尖[7-9]、成熟胚[10，11]等进行遗传转化。这些转化方法往往需要消耗大量人力物力并有一定的基因型依赖性。由于适合进行组织培养的基因型不具备较好的农业性状，因此给进一步的转基因玉米新品种选育工作带来较多阻碍。利用农杆菌介导玉米萌动胚[12，13]能够较好地解决这一问题，因此适合针对农艺性状好但组织培养体系尚未建立的玉米自交系的遗传转化工作。本研究利用农杆菌介导方法转化玉米萌动胚的方法将克隆的ALS基因转化到玉米基因组中，分析转基因后对除草剂甲磺隆的抗性，为创建抗除草剂转基因玉米新品种打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物材料：JVO16为吉林省农业科学院玉米研究所实验室保存。结缕草（Zoysia japonica Steud.）种子购自花卉市场。

菌种质粒：质粒pCAMBIA3300、农杆菌EHA105为吉林省农业科学院玉米研究所实验室保存。

试验药品：限制性内切酶、连接酶购自Promega公司，Trans Taq DNA Polymerase High Fidelity （HiFi） Taq酶购自北京全式金生物工程公司，胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。200 bp ladder Marker购自加拿大MBI公司。

1.2 试验方法

1.2.1 抗甲磺隆ALS基因的获得 取1 000粒野生型结缕草种子种植于花盆中，待植株生长至10 cm时喷洒1%甲磺隆溶液。取存活下来的植株，通过CTAB法提取植物总DNA。根据NCBI上已知的ALS基因序列设计引物Primer1、Primer2，通过PCR扩增获得ALS基因。模板用根据已发表的PR10a启动子序列（Genbank AB513331.1）设计的引物扩增。引物序列为：

Primer1：5′-CTCGAGATGGCCACCACCCCGACAAC-3′

Primer2：5′-CTCGAGCACTGAAGATATAATCTAAC-3′

PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物连入TA克隆载体pEAZY-T1，交由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，并用DNAMAN和DNASIS软件对其进行序列分析。

1.2.2 植物表达载体的构建 用Xho I将pEAZY-ALS上的ALS基因切下，连接到用相同酶切的p3300大片段上，经Xho I酶切验证正确后，命名为p33-ALS。

1.2.3 转化和筛选 挑选500粒饱满、无损伤的玉米种子，经0.1%氯化汞浸泡消毒后，加入150 mL无菌水，室温90 r/min振荡12 h。将吸水膨胀种子进行划胚处理后，加入15 mL OD值为1的农杆菌菌液，共培养48 h。将共培养后的种子播种在含有蛭石的营养土中，当玉米苗长至三叶一心期时，用0.5%的甲磺隆溶液喷洒筛选。筛选存活的玉米植株，经PCR检测表现阳性的植株移至大盆，继续生长直至结实。

1.3 PCR检测

采用CTAB法提取6叶期除草剂抗性玉米的总DNA，以此为模版进行PCR扩增，检测ALS基因是否插入玉米基因组中。ALS基因检测用的引物序列如下：

Primer3：5′-GGAGTGACGTTGGGGCATC-3′

Primer4：5′-ACTCGTGTGACGGCAGGAC-3′

预期扩增片段长度为526 bp。

PCR扩增总反应体系为25 μL，其中2×Taq PCR Master Mix（北京天根生物技术有限公司） 12.5 μL，上下游引物各1 μL（10 nmol/μL），DNA模板1 μL（100 ng/μL），ddH2O 9.5 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；之后94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环；最终72 ℃延伸8 min。试验以未转化植株的DNA为阴性对照，以质粒DNA为阳性对照，同时设立去离子水为模板的空白对照。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 除草剂抗性试验

将非转基因玉米和经过PCR检测为阳性的玉米植株后代种植于土壤中，待长至三叶一心期时，用0.5%、1.0%、2.5%、5.0%的甲磺隆溶液喷洒筛选分析除草剂抗性。

2 结果与分析

2.1 片段的克隆与序列分析

PCR产物经电泳检测，结果表明，成功获得了与目的基因大小相符的约为2 kbp的DNA片段（图1A）。片段插入TA克隆载体pEAZY-T1后，命名为pEAZY-ALS。测序结果表明，PCR扩增所获得的ALS基因序列全长1 938 bp，与报道序列（GenBank accession number AB513331.1）有34个碱基的差异，同源性为98.6%，所编码的氨基酸有3个位点发生了改变，经与除草剂敏感型水稻、除草剂抗性水稻的ALS蛋白序列进行比较后发现，其中第549位、628位改变与其抗性产生相关，而第55位氨基酸的差异仅为进化中产生的随机突变（图1B）。与玉米ALS蛋白序列比较结果表明两者之间有88.9%的同源性，而玉米内源的ALS蛋白中第549位、第628位氨基酸与除草剂敏感型水稻一致，属于除草剂敏感型。为进一步进行遗传转化提高玉米除草剂抗性提供了依据。

2.2 p33-ALS 植物表达载体的构建

如图2A所示，通过亚克隆将ALS基因替换p3300上的bar基因。用XhoⅠ酶切pEAZY-ALS和p3300，分别回收pEAZY-ALS酶切产物中的小片段和p3300酶切产物中的大片段，用T4 DNA连接酶连接转化大肠杆菌。用XhoⅠ酶切鉴定释放出长约1.98 kbp的片段（图2B），最终经测序证实插入方向正确的重组载体命名为p33-ALS。

2.3 除草剂抗性植株的获得及PCR检测

从图3A所示的植物株中经过筛选共计获得抗除草剂玉米植株7株（图3B），经PCR扩增检测的结果如图3C所示，获得的7株抗性植株均为阳性植株，转化率为1.4%。

2.4 除草剂抗性试验

经过不同的甲磺隆溶液喷洒1周后，0.5%甲磺隆溶液即可对野生型玉米植株产生影响，由图4可知，野生型植株在用5%甲磺隆溶液喷洒后1周即完全死亡，而T1代PCR阳性的转基因植株几乎完全不受影响。

3 结论与讨论

本研究分离得到的ALS基因导入玉米基因组后能够极大地提高对甲磺隆的耐受能力。T1代的除草剂试验表明外援基因已整合到基因组中并能够顺利的遗传到后代。对该基因所编码的氨基酸序列进行分析发现，第549位W转变为L、第628位S转变为I，与水稻ALS蛋白对甲磺隆抗性的突变结果一致，进一步证实了这两个位点与甲磺隆抗性相关，为进一步研究该基因功能提供佐证。

尽管利用植物组织培养等方法能够获得转基因植株，但是往往由于长时间的继代、筛选等过程导致再生植株出现各种非遗传方面的变异。而农杆菌介导的萌动胚转化法，集传统的农杆菌介导法和不依赖于组织培养转化法的优点于一身，是玉米转基因方法中优良的备选方案。因此，本试验选用了该方法作为创建转基因玉米种质的手段。

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