蘸花法在植物遗传转化上的应用研究进展

齐雯雯　宫晓琳　王洋　吴莹

摘要 植物遗传转化是基础理论研究和农作物性状改良的必要手段。随着蘸花法在十字花科植物中的成功应用被越来越多的学者关注，并用于许多模式植物及农作物的遗传转化。蘸花法简便、高效、稳定性好，转化后可直接获得转基因种子。该文介绍了蘸花法的原理，分析影响转化效率的因素，并总结了目前已成功应用蘸花法的研究情况及筛选转基因后代的优化方法。

关键词 遗传转化；蘸花；转化效率；筛选

中图分类号 Q-33 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）24-0009-02

遗传转化是植物转基因操作的关键环节。早期的转化技术如叶盘法、共培养法均涉及到植物组织培养和再生，体细胞易变异产生不利影响[1]。Feldmann于1987年首次提出原位渗透转化法，用农杆菌浸染刚萌发的拟南芥种子并筛选出转化阳性植株，避免了组织培养[2]。随后，Bechtold在原位渗透转化基础上建立了真空渗透法（vacuum infiltration），用处于花期的植株取代种子，倒置于农杆菌菌液，同时抽真空处理，转基因效率明显提高[3]。1998年，Clough和Bent在菌液中加入表面活性剂Silwet L-77，取消抽真空，建立了蘸花法（floral dip），其转化效率与真空渗透法相近[4]。Chung等发现喷雾（floral spray）处理可代替浸蘸花器，在保障转化效率的前提下扩大了应用范围[5]。蘸花法操作简单，转化效率高，转化后可直接获得转基因种子，避免了体细胞或原生质体培养的过程及移栽成活率低等问题。该文介绍蘸花法原理，总结转化效率影响因素的优化方案及转基因后代的筛选方法，为应用蘸花法进行遗传转化提供重要的技术策略。

1 转化机理

研究表明，T-DNA携带的目的基因是异源插入[3]。拟南芥自花授粉，异源插入可能发生于花发育后期。Desfeux等单独浸染拟南芥的雄蕊和雌蕊，在雌蕊后代中检测到转化株，而雄蕊后代中未发现，表明雌蕊是转化的受体[6]。农杆菌浸渍处理后，GUS染色发现胚珠显色，而花粉和花药未显色，说明转化的有效部位为雌配子体，但不排除雄配子体存在小概率转化[6]。拟南芥的子房室不总关闭，卵细胞发育突出，会延伸成瓶状结构并在顶部开口，花发育后期子房室顶部闭合。转化一般在花芽形成前5～10 d进行，此时雌蕊开放，农杆菌进入子房并将T-DNA转移到卵细胞[7]。

2 影响蘸花法转化效率的因素

蘸花法转化效率受多重因素影响，且在不同物种间存在差异。近年来，关于蘸花法影响因素分析的报道增多，已在拟南芥[4-7]、甘蓝型油菜[8-9]、苜蓿[10]等不同的物种中分析了农杆菌、蔗糖、表面活性剂、浸染次数及间隔等因素对转化效率的影响（表1）。

2.1 植物发育时期

蘸花法需在长出花序的植株上进行，多数植物以初花期为最佳转化时期。拟南芥在主枝切除、次级分枝仅有少许花开放时转化效率最高[4]；白菜的最适浸染时期为花薹抽出期[16]；甘蓝型油菜花薹抽出时，摘除主薹1周后浸染最适[8]；萝卜浸染的最适时期为初薹发育期[14]。

2.2 表面活性剂的种类及用量

表面活性剂有很强的吸附性和渗透能力，能减少液体的表面张力，利于农杆菌的吸附。Clough等加入0.02%的Silwet L-77使转化效率提高2倍[4]。Curtis等用含有3种不同表面活性剂的菌液转化萝卜，对比得出Silwet L-77转化效率最佳，Pluronic F-68次之，Tween 20最低[14]。Mireault等用XIAMETER OFX-0309代替Silwet L-77，使转化效率提高了3倍[19]。表面活性剂浓度过高对植株有明显的伤害，可致植株枯萎，Silwet L-77的浓度建议为0.02%～0.05%，不应超过0.1%。

2.3 蔗糖浓度

蔗糖能保持花粉内外压强一致，并为转化提供能量，利于农杆菌在受体表面生存。蔗糖还能诱导vir基因的表达，利于农杆菌的转化[1]。蔗糖浓度过高会导致细胞失水，严重时细胞死亡。Clough等发现无蔗糖时蘸花法转化效率极低，蔗糖浓度为10%时转化效率最高，但结合转化稳定性，建议蔗糖浓度为5%[4]。可用食用级蔗糖或葡萄糖代替试剂级蔗糖以节约成本。

2.4 浸渍时间、次数

Chung等发现浸渍时间由5 s延长至5 min会使转化效率提高2倍[5]，但浸渍时间过长会影响花序成活率。Clough等试验表明，3次浸渍比单次处理的转化效率提高1倍[4]。多次浸渍处理的转化效率较高，是由于农杆菌在植物体内的转化反复发生，其活性会随时间的延长而下降，多次浸渍可增加活性农杆菌的数目，进而提高转化效率。Clough等发现，2次浸渍的间隔少于4 d或超过2周均会给转化植株造成不利影响[4]。因此，应结合植株的生长状态来确定最佳的浸渍时间、次数及间隔。

2.5 其他因素

Miguel等把农杆菌的OD600从0.8提高到2.0，其转化效率从2%提高到3%，说明适度提高农杆菌的细胞密度可提高转化效率[11]。农杆菌菌株的类型对转化效率有影响[20]，试验表明，农杆菌GV3101的转化效率高于LBA4404[13]。浸渍试验多选择在温度较低的时段进行，利于T-DNA整合入植物细胞。接种后用塑料膜覆盖保湿，利于菌液和植物充分接触，时间控制在12～24 h。接种方式有多种，针对不方便倒置浸渍的植物，可用微量进样器将渗透缓冲液逐滴加到花序[15]，或用注射器将缓冲液注入花苞[18]；需大批量转化可用喷雾法[21]，但渗透缓冲液对身体有害，需注意安全防护；而转化效率较低的物种，可在蘸花时用抽真空辅助[4]。

3 蘸花法转化后代的筛选与鉴定

蘸花法是农杆菌介导的T-DNA转化，外源DNA可整合入受体细胞。可根据浸渍时菌株质粒所携带的标记基因确定筛选方案，通过观察植株状态确定转化株；也可PCR鉴定标记基因或GUS染色，确定转化株及转化效率。Clough等将转化后的T0代拟南芥种子消毒并播种到含有适量卡那霉素的MS培养基上筛选，并提取转化株的基因组DNA进行杂交检测确定转化效率[4]。Cao等用草丁膦筛选小白菜转化后代，并PCR鉴定C58质粒上的virG 基因确定转化株[22]。为减少筛选时间以提高效率，Harrison等调整培养光照时间，将筛选时间由7～10 d缩短为3.25 d[23]。Davis等用色谱沙筛选转化后代，无需对种子消毒，节省了时间和成本且避免污染[24]。

4 蘸花法的应用与展望

近年来，蘸花法转化的相关报道逐渐增多。随着蘸花法的改进，已在基因工程等领域广泛运用，如T-DNA转移及整合、基因的功能分析、突变体库的构建等[25-26]。该方法在多个物种中成功应用，其中除了萝卜[14]、盐芥[17]等十字花科植物，还包括重要的农作物如小麦[12]和经济作物如豆科植物[10，13]等。由于技术方法的限制，蘸花法仍有不足，如目前没有通用的组合方案，转基因后代需自交筛选获得纯合体等。因此，进一步完善蘸花法技术体系可为植物转基因研究提供更多便利，为提高农作物抗逆性、抗虫害、抗病性等提供有效途径。

5 参考文献

[1] 韦献雅，付绍红，牛应泽.农杆菌介导floral-dip转基因方法研究进展[J].中国油料作物学报，2006，28（3）：362-367.

[2] FELDMANN K A，MARKS M D.Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana：A non-tissue culture approach[J].Molecular and General Genetics，1987，208（1-2）：1-9.

[3] BECHTOLD N，ELLIS J，PELLETIER G.In planta Agrobacterium-medi-ated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants[J].Life Sciences，1993（316）：1194-1199.

[4] CLOUGH S J，BENT A F.Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J].The Plant Journal，1998，16（6）：735-743.

[5] CHUNG M H，CHEN M K，PAN S M.Floral spray transformation can efficiently generate Arabidopsis transgenic plants[J].Transgenic Research，2000（9）：471-476.

[6] DESFEUX C，CLOUGH S J，BENT A F.Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method[J].Plant Physiology，2000，123（3）：895-904.

[7] SMAGUR A W，KONKA K H，KONONOWICZ A K.Flower bud dipping or vacuum infiltration-two methods of Arabidopsis thaliana transformation[J].Russian Journal of Plant Physiology，2009，56（4）：560-568.

[8] WANG W C，MENON G，HANSEN G.Development of a novel Agrobact-erium-mediated transformation method to recover transgenic Brassica napus plants[J].Plant Cell Reports，2003，22（4）：274-281.

[9] LI J，TAN X L，ZHU F G，et al.A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets[J].International Journal of Biology，2010，2（1）：127-131.

[10] TRIEU A T，BURLEIGH S H，KARDAILSKY I V，et al.Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium[J].The Plant Journal，2000，22（6）：531-541.

[11] TRUJILLO M M，BRIONES V L，PONCE J L C，et al.Improving trans-formation efficiency of Arabidopsis thaliana by modifying the floral dip method[J].Plant Molecular Biology Reporter，2004，22（1）：63-70.

[12] ZALE J M，AGARWAL S，LOAR S，et al.Evidence for stable transform-ation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Cell Reports，2009，28（6）：903-913.

[13] 王翠艳，丁东风，于晓菊，等.Floral dip法在大豆遗传转化中的应用研究[J].南开大学学报：自然科学版，2010，43（1）：34-38.

[14] CURTIS I S，NAM H G.Transgenic radish（Raphanus sativus L. longipi-nnatus Bailey）by floral-dip method-plant development and surfactant are important in optimizing transformation efficiency[J].Transgenic Res-earch，2001，10（4）：363-371.

[15] 代法国，胡宗利，陈国平，等.一种获得转基因芥菜的简便方法[J].生命科学研究，2011，15（1）：19-23.

[16] GAO Y，REN X L，RUAN S L，et al.Genetic transformation of Chinese cabbage（Brassica rapa pekinensis）with floral-dip method[J].Agricultural Biotechnology，2012，1（4）：22-24，27.

[17] BRESSAN R A，ZHANG C Q，ZHANG H，et al.Learning from the Ara-bidopsis experience.The next gene search paradigm[J].Plant Physiology，2001，127（4）：1354-1360.

[18] 陈彦，孙宽莹，张涛.通过改良农杆菌介导的floral-dip法和花粉管通道法转化紫薇[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，2012，38（3）：250-255.

[19] MIREAULT C，PARIS L E，GERMAIN H.Enhancement of the Arabidopsis floral dip method with XIAMETER OFX-0309 as alternative to Silwet L-77 surfactant[J].Botany，2014（92）：1-3.

[20] GHEDIRA R，BUCK S D，NOLF J，et al.The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant[J].Molecular Plant-Microbe Interactions，2013，26（7）：823-832.

[21] 张森.喷雾：一种简便的拟南芥转化方法[J].生物技术，2006，16（5）：36-38.

[22] CAO M Q，LIU F，YAO L，et al.Transformation of pakchoi（Brassica rapa L. ssp.chinensis）by Agrobacterium infiltration[J].Molecular Breeding，2000，6（1）：67-72.

[23] HARRISON S J，MOTT E K，PARSLEY K，et al.A rapid and robust method of identifying transformed Arabidopsis thaliana seedlings following floral dip transformation. Plant Methods，2006，2（1）：19-27.

[24] DAVIS A M，HALL A，MILLAR A J，et al.Protocol：streamlined sub-protocols for floral-dip transformation and selection of transformants in Arabidopsis thaliana[J].Plant Methods，2009，5（1）：3-7.

[25] GALAU S J，BELLEC Y，FAURE J D，et al.Evaluation of the potential for interspecific hybridization between Camelina sativa and related wild Brassicaceae in anticipation of field trials of GM camelina[J].Transgenic Research，2014，23（1）：67-74.

[26] CHRISTIAN M，QI Y P，ZHANG Y，et al.Targeted mutagenesis of Arabidopsis thaliana using engineered TAL effector nucleases[J].G3：Genes | Genomes | Genetics，2013（3）：1697-1705.