不同抗生素对刺槐遗传转化受体系统的影响

2014-07-18 10:26韩义等

山东农业科学 2014年4期

韩义等

摘要：

本试验研究了卡那霉素（Kana）、头孢霉素（Cef）、氨苄青霉素（Amp）、羧苄青霉素（Carb）、红霉素（E）对刺槐形成层为外植体的遗传转化受体系统的影响。结果表明：刺槐形成层诱导愈伤时Cef对受体材料伤害最小，抑菌效果最好，浓度为200 mg/L时能完全抑制农杆菌生长；用Kana作为刺槐转基因植株的筛选，刺槐形成层愈伤组织分化时选择剂浓度为100～125 mg/L最佳，生根培养时选择剂浓度为75 mg/L最佳。

关键词：刺槐；遗传转化；抗生素；形成层

中图分类号：S792.270.4 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）04-0031-05

刺槐（Robinia pseudoacacia L.），适应性强，生长快，材质好，用途广，繁殖容易，是人工造林的优选树种[1]，但其有限的耐盐能力却限制其栽种范围。应用基因工程技术提高刺槐耐盐性是拓展其用于重盐碱地区造林和绿化的重要途径。我们从刺槐中克隆了定位于液泡膜的Na+/H+逆向转运蛋白基因RpNHX1，并构建含35S强启动子表达载体pBI121-RpNHX1用于刺槐遗传转化。

在植物遗传转化的多种技术中，农杆菌介导的转化方法因其操作简单、转化率高、拷贝数少等优点成为常用的有效转化方法，广泛应用于双子叶植物的遗传转化[2～6]。应用农杆菌介导法进行植物遗传转化时，一般经过农杆菌侵染、共培养、选择培养、转基因植株再生等多个环节，除侵染和共培养外，其余环节都要用到抗生素作为筛选转化体的抗性选择剂和农杆菌生长的抑制剂，因此研究抗生素对遗传转化受体系统的影响是遗传转化受体系统建立的必经环节[7，8]。不同种类抗生素抑菌效果不同，对受体材料影响也不同，因此抗生素种类选择和剂量方案都需要在实验中加以确定。目前遗传转化中常用的抑菌类抗生素主要有头孢霉素（Cefotaxime， Cef）、氨苄青霉素（Ampicillin， Amp）、羧苄青霉素（Carbenicillin， Carb）、红霉素（Erythromycin， E）等。抑菌类抗生素通常用以防止遗传转化过程中农杆菌过度增殖对植物细胞造成伤害和杂菌污染。选择抑菌类抗生素既要有效抑制农杆菌的生长还要最大限度减少对受体材料的影响。选择性抗生素用于转基因植株的筛选和检测，这类抗生素的选择只能根据转基因植株所携带的抗性基因决定，我们构建的表达载体pBI121-RpNHX1含有编码npt Ⅱ基因（提供卡那霉素抗性），因此本试验选卡那霉素（Kanamycin， Kana）用于转基因植株的筛选和检测。本研究的目的是确定农杆菌介导RpNHX1基因在刺槐遗传转化过程中抑菌剂的种类和最佳剂量方案，以及用于不同阶段进行抗性筛选的卡那霉素剂量方案，为下一步进行遗传转化提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试刺槐为山东农业大学筛选的刺槐耐盐优良无性系W009，2008年定植于山东农业大学林学试验站。农杆菌菌株LBA4404含重组质粒pBI121-RpNHX1具卡那霉素抗性，构建于2012年4月，-70℃保存，其中载体pBI121由山东农业大学教授樊金会惠赠。供试卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢霉素、红霉素购于SIGMA公司。

1.2 不同抗生素对农杆菌的抑制作用

挑取含重组质粒的LBA4404单菌落于2 mL YEP液体培养基中振荡培养活化（28℃，200 r/min）过夜，取1 mL新鲜菌液接种于50 mL YEP培养基中，培养至对数生长期，3 000 r/min离心5 min收集菌体，并重悬稀释菌体至OD600值为0.6。取直径1 cm左右刺槐茎段截成3～5 cm小段，用洗洁净水浸泡10 min，软毛刷清洗表面，流水冲洗2 h，在超净工作台上灭菌，70%酒精30 s，0.1%升汞3 min，无菌水冲洗7～8遍，用无菌滤纸吸干表面水分后刮去表皮，取形成层切成0.5 cm×0.5 cm小块，形成层内侧向下贴在培养基表面，预培养24 h后，在超净工作台上取出于菌液中侵染10 min，用无菌滤纸吸去多余菌液，共培养3 d后接入含有抑菌类抗生素的培养基中。7 d观察记录一次，30 d后统计结果。样本容量为40，重复3次，培养温度25℃、空气相对湿度60%、光照8 h/d、光强1 000 lx。

1.3 抗生素对刺槐形成层愈伤组织诱导试验

将灭菌后的外植体（材料及方法同上）接种于含不同浓度的Amp、Carb、E、Cef的诱导培养基WPM+1.2 mg/L KT+1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA+3%蔗糖+100 mg/L水解酪蛋白中。对照为不加抗生素。7 d观察记录一次，30 d后统计分化情况。样本容量为40，重复3次，培养温度25℃、相对湿度60%、光照8 h/d、光强1 000 lx。

1.4 Kana对刺槐形成层愈伤组织分化的影响

将刺槐形成层诱导形成的愈伤组织切成0.5 cm2左右小块接种于含不同浓度Kana的分化培养基1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3%蔗糖+100 mg/L水解酪蛋白中。对照为不加抗生素。7 d观察记录一次。样本容量为40，重复3次，培养温度25℃、相对湿度60%、光照14 h/d、光强1 500 lx。

1.5 Kana对刺槐瓶苗生根试验

将继代两次的瓶苗接种于MS空白培养基进行复壮后，截成1～2 cm带芽小段接种于含不同浓度Kana的生根培养基1/2MS+1.2 mg/L IBA+1.5%蔗糖+1.0～2.0 g/L活性炭中。7 d观察记录一次，20 d后统计生根率。

2 结果与分析

2.1 抑菌剂的选择及最佳抑菌浓度确定

2.1.1 抗生素Cef、Amp、Carb、E对刺槐形成层诱导愈伤的影响统计结果表明，抗生素浓度在50～250 mg/L范围内，随着培养基中抗生素浓度的升高，刺槐形成层愈伤组织诱导及分化率呈下降趋势，刺槐形成层对四种抗生素敏感程度不同。四种抗生素对刺槐形成层诱导愈伤的抑制作用 Amp>Carb>Cef、E。Cef、E比Amp和Carb更适合做刺槐形成层诱导愈伤的抑菌剂（图1）。

2.1.2 抗生素对农杆菌的抑制作用农杆菌侵染过的刺槐外植体接种到诱导培养基中，如果农杆菌过度增殖就会对外植体产生毒害作用甚至使其变褐死亡。因此在培养基中加入抗生素抑制农杆菌的生长是必不可少的。试验结果（表2）表明，四种抗生素抑菌作用Cef>Amp、Carb>E。Cef抑菌效果最优，浓度达到200 mg/L时已经完全抑制农杆菌的生长。

抑菌剂的选择要综合考虑其对农杆菌的抑菌效果和对外植体的影响。分析图1四种抗生素均会对刺槐形成层诱导愈伤组织产生抑制作用，但敏感程度不同，在低浓度下（50 mg/L）Amp和Carb对刺槐形成层诱导愈伤组织产生抑制作用，诱导率分别为67.5%和82.5%，低于对照（92%）；相同浓度的Cef和E对愈伤组织诱导的抑制不明显，诱导率分别为92.5%和92.0%。随着抗生素浓度的增加，愈伤组织诱导率均有下降，但相同浓度下添加Cef和E的愈伤组织诱导率要明显高于添加Amp和Carb。在抗生素浓度为200 mg/L时培养基中添加Cef和E的愈伤组织诱导率仍维持在65%的较高水平，而相同浓度Amp和Carb愈伤组织诱导率分别为22.5%和42.5%。四种抗生素对农杆菌的抑菌效果为Cef>Amp、Carb>E，综合考虑，Cef最适合作为刺槐形成层为外植体的遗传转化的抑菌剂，最佳抑菌浓度为200 mg/L。

2.2 选择剂Kana浓度的确定

2.2.1 Kana对刺槐形成层愈伤组织分化的影响在再分化培养基中添加Kana能明显抑制刺槐形成层愈伤组织分化产生不定芽。在不添加Kana的培养基中，愈伤组织培养2周开始分化产生不定芽，分化率为12.5%，培养5周后分化率高达87.5%（表2、图2f）。在添加Kana 50 mg/L的培养基中，随培养时间延长，愈伤组织开始出现变褐死亡的现象，培养5周仍有22.5%愈伤组织分化产生不定芽。随着Kana浓度增加，愈伤组织分化率降低，愈伤组织出现死亡的时间提前，死亡率升高。当Kana浓度达到100 mg/L时，愈伤组织死亡率高达75.0%，分化率则降到7.5%。当Kana浓度达到125 mg/L时，愈伤组织死亡率进一步升高，而愈伤组织再分化已经完全被抑制。由此可见，100～125 mg/L 的Kana可作为刺槐遗传转化形成层愈伤组织筛选较适宜的浓度。

2.2.2 Kana对刺槐瓶苗生根的影响刺槐瓶苗生根对Kana反应较敏感（表3），随着Kana浓度增大，瓶苗生根率迅速降低。在不添加抗生素的培养基中，瓶苗生根率为100%（图2g）。当Kana浓度为50 mg/L时，瓶苗生根率降为22.5%，当Kana浓度达到75 mg/L时，瓶苗生根已经完全被抑制，从生根数量上看，随着Kana浓度升高，瓶苗生根数量逐渐减少。由此可见，在刺槐转基因植株生根时添加选择剂75 mg/L即可达到良好的效果。

3 结论与讨论

在农杆菌介导的遗传转化试验中，抑菌类抗生素的选择必须综合考虑对农杆菌抑制作用和对植物组织生长的影响两方面因素。目前广泛使用的抑菌类抗生素有三类，青霉素类（氨苄青霉素、羧苄青霉素、青霉素-G等）、头孢霉素类（头孢霉唑林钠、头孢霉呱酮钠、头孢拉定、头孢霉西林钠、头孢霉曲松钠等）、大环内酯类（红霉素、白霉素等）[7]。植物对抗生素的敏感程度差别很大，不同物种间、同种植物不同品种间甚至同一株植物的不同部位做外植体时对抗生素敏感程度都不同[9]。有的研究中指出羧苄青霉素等对培养中的外植体有促进作用，因其与生长素2，4-D和NAA等有相似的化学结构[10～13]。本研究中，刺槐形成层为外植体的愈伤组织诱导对Cef、Carb、Amp、E四种抗生素的敏感程度为Amp>Carb>Cef、E，对农杆菌的抑菌作用试验显示四种抗生素抑菌效果为Cef>Amp、Carb>E。综合考虑，刺槐形成层为外植体的遗传转化中Cef对外植体的生长抑制作用最小，抑菌效果最好，浓度为200 mg/L时已经能完全抑制农杆菌的生长，因此在后续的遗传转化过程中应选Cef作为抑菌剂，侵染后初次使用浓度为200 mg/L，随继代次数增加逐渐降低使用浓度直至除去。

选择剂能够对转基因植株进行筛选是通过抗生素抗性基因起作用的。本研究中选用卡那霉素作为选择剂是因为用于刺槐遗传转化的重组质粒具有新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ）标记基因。npt Ⅱ基因编码的产物氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3/）Ⅱ-酶）能对氨基糖苷类抗生素具有抗性[14]。Kana能够与非转基因植物细胞内线粒体和叶绿体结合而毒害植物绿色器官使其黄化死亡[15]。Kana浓度过高会很快杀死植物组织甚至对转基因植株产生毒害作用。不同受体材料对选择剂敏感程度不同[16，17]，相同材料不同培养阶段对选择剂的敏感程度也有差异。因此在遗传转化之前需要设计试验确定受体材料对选择剂的敏感性。本研究中，刺槐形成层愈伤组织分化过程中添加Kana浓度为100～125 mg/L能起到良好的筛选作用，生根培养时添加Kana 75 mg/L能完全抑制不定根的产生。

参考文献：

[1]

梁玉堂，龙庄如. 刺槐栽培理论与技术[M]. 北京：中国林业出版社， 2010.

[2] Vengadesan G， Amutha S， Muruganantham M， et al. Transgenic Acacia sinuata from Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of hypocotyls[J]. Plant Cell Reports，2006， 25（11）：1174-1180.

[3] Kanwar K， Bhardwaj A， Agarwal S， et al. Genetic transformation of Robinia pseudoacacia by Agrobacterium tumefaciens[J]. Indian J. Exp. Biol.， 2003， 41（2）：149-153.

[4] 余叔文. 植物生理与分子生物学 [M]. 北京：科学出版社，1998.

[5] 张福丽，李季平，高丹，等. 影响农杆菌介导的植物转基因的因素[J]. 生命科学研究， 2011，15（5）：449-454.

[6] Wu H， Sparks C， Aoan B， et al. Factors influencing successful Agrobacterium-mediated genetic transformation of wheat [J]. Plant Cell Reports， 2003， 21（7）：659-668.

[7] 郑进，康薇，洪华珠. 抗生素在农杆菌介导植物转基因中的应用[J]. 林业科技开发， 2006，20（3）：8-11.

[8] 李文兰，李华英，盛小伟.不同抗生素对罗汉果遗传转化受体系统的影响[J].分子植物育种， 2010，8（3）：529-532.

[9] 王伟，王义强，徐刚标. 根癌农杆菌介导Caz基因转化烟草条件研究[J]. 经济林研究， 2007，25（2）：35-38.

[10]肖硕，彭建华，洪华珠. 抗生素对刺槐组织培养丛生芽分化的影响[J]. 湖北林业科技， 2009（3）：24-26.

[11]Lin J J， Nacyra A G， Kou J. Plant hormone effect of antibiotics on the transformation efficiency of plant tissue by Agro-bacterium tumefaciens cells[J]. Plant Sci.， 1995， 109（2）：171-177.

[12]林凤，张春宇，王洪岩，等. 抗生素对高梁茎尖再生的影响及再生体系的建立[J].中国生态农业学报， 2005，13（2）：74-76.

[13]吴关庭，胡张华，郎春秀，等，抗生素对高羊茅胚性愈伤组织生长与分化的影响[J].核农学报， 2005，19（2）：88-91.

[14]王关林，方宏笃. 植物基因工程[M].北京：科学出版社，2002.

[15]李燕娥，焦改丽，李淑君，等. 转基因棉花纯合系获得和遗传分析研究[J].中国农业科学， 1998，31（3）：44-47.