两种钛合金-骨界面的力学生物学研究*

郑凯于秀淳*郭征李小康

论著·实验研究

两种钛合金-骨界面的力学生物学研究*

郑凯1于秀淳1*郭征2*李小康2

目的研究两种钛合金-骨界面的力学及生物学特性，从力学生物学的角度探讨不同钛合金-骨界面对骨细胞生物学行为的影响。方法通过建立钛合金内植物与骨相互作用的力学模型，分析材料属性变化对钛合金-骨界面力学性能变化的影响。通过动物体内实验，运用Micro-CT分析技术及组织切片观察不同钛合金-骨界面骨细胞生物学行为。结果钛合金-骨界面力学模型的理论推导和分析提示：TAV-骨界面的相对位移约是Ti2448-骨界面的相对位移的1.8倍。动物实验结果提示：Ti2448-骨界面周围骨质骨矿含量及骨质量均优于TAV-骨界面周围骨质。结论对于钛合金-骨界面而言，相对位移可能是力影响骨细胞功能的作用因素，较小的相对位移更有利于界面骨细胞的增殖，通过降低材料弹性模量，能够有效减低钛合金-骨界面相对位移，是实现钛合金-骨界面的更好愈合的可行方案。

钛合金-骨界面；力学生物学；相对位移；弹性模量

19世纪后期，Roux提出功能适应理论，他推测压力刺激骨形成，张力刺激结缔组织形成，与拉伸或压缩有关的相对位移，如组织间相对移动刺激软骨形成。该假设已被广泛接受，但在祖细胞分化到骨过程中发挥作用的重要力学参数和机制仍需继续研究和探索。

力学生物学是21世纪新诞生的一门学科，为我们带来了新的概念的同时，也带给我们新的研究工具和深刻的思想变革，使我们开始关注于力学负载下的细胞功能变化，这将使得我们更加深入的认识力与骨的关系，指导基础研究和临床工作，正如戴尅戎院士指出的：通过对骨的力学生物学研究，将有望设计一种更适宜且更安全的训练方式来促进骨量的增加，降低骨折发生的危险概率，并且也有望为诸如骨质疏松症、骨关节炎、骨折愈合等与骨重建、骨塑形和骨适应性相关的疾病，寻求一条预防和治疗的新途径[1]。

界面问题是生物材料组织特性的研究难点，也是材料生物力学的研究热点，更是医用植入材料不可回避的研究重点。目前医用钛合金主要是较为成熟的 +钛合金和新兴的 钛合金[2]，本文从力学生物学的角度对比研究 钛合金Ti-24Nb -4Zr-7.9Sn（Ti2448）和常用 +钛合金Ti-6Al-4V（TAV）两种不同属性材料的钛合金-骨界面对骨细胞功能的影响，分析材料属性变化与骨组织细胞行为之间的关系，探讨生物力影响骨细胞功能的可能的作用方式。

1 材料与方法

1.1 建立生物金属材料骨界面的力学模型

1.1.1 建立钉帽模型模拟金属-骨界面力学特性

绝大多数骨组织中植入的金属材料与骨界面的相互力学关系均可等价为钉帽模型，植入材料可视为螺钉，而骨组织可视为螺帽（如图1）。这种紧密的钉帽契合力学关系可视如楔入骨组织的金属植入物与骨组织紧密的界面力学关系。

骨与材料之间的界面的相对移动对于骨形态的影响不容置疑，我们通过建立钉帽模型，从力学角度分析骨与材料界面之间的相互关系。图1中，L是指垂直于螺钉的包括螺杆及螺纹的宽度（L=LB+LN，令：LB=LN）。力作用于螺帽（N）及螺钉（B）的面积分别设AN和AB，其弹性模量分别为EN和EB。FN为加载于螺帽上的力学载荷，如同正常的骨组织负荷力传导至植入材料的一侧骨质上。根据微积分中微分的思想，FN的一个分量dF传递至其他部分（包括各种植入物力学结构体），剩下的力学载荷分量F—dF作用于螺帽上引起形变dLN，在假设金属材料及骨质均是刚性结构的条件下，dLN可描述成：

根据“力的作用是相互的”这个原理，同样的载荷将由螺帽反作用于螺钉，将引起螺钉形态：

界面总位移可表述为（依据刚度系数：1/EBAB=I/SB，1/ EN AN=1/SN，dS=SB—SN）

图1 钉帽模型，其上有一力学载荷F，L=LB+LN令：LB=LN

1.1.2 加载条件及推导

若dS=0，即螺钉与螺帽有同等的刚度，那么界面相对位移为：

这种加载条件目前的生物金属材料尚不能达到，可近似于临床中骨折的一期愈合的力学条件，理想状态下，骨折后完美复位，骨折块相互没有位移，没有骨痂。

若dS=SN或dS=9SN，等价于SB=2SN（近似于Ti2448）或SB=10SN（近似于TAV）

其上的理论推导提示，在螺帽等价于骨质，其刚度不变的情况下，螺钉等价的内置物，其刚度越大，骨材料界面的相对位移也越大。其相对位移的比值为1∶1.8，即理论推导情况下，TAV与骨界面的相对位移是Ti2448与骨界面相对位移的1.8倍。

1.2 动物实验

1.2.1 材料制备

单边外固定系统一般由三部分组成，半针、外固定套夹及外固定棒。外固定棒均为采用长15.0cm，直径6.0mm碳纤维固定棒，外固定套夹均为骨科常用的不锈钢套夹，半针由两种材料分别制成，高弹性模量外固定系统的半针材料为骨科常用的弹性模量为110GPa的Ti-6Al-4V（TAV），低弹性模量外固定系统的半针材料为弹性模量为33GPa的 钛合金 Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn（Ti2448，中科院金属研究院提供，国家专利号：200310119498.5，PCT国际专利号：PCT/CN2004/001352，加工两种材料制成直径3.0mm，长10.0cm，螺纹段长1.0cm，螺距1.5mm的外固定半针。

1.2.2 动物模型

选用由第四军医大学动物实验外科提供的健康杂种犬20只，体重：15～20Kg，月龄：10～14月，将其随机分成A、B两组，每组各10只，术前高温高压消毒内固定半针及外固定套夹，熏消碳纤维固定棒，实验犬分笼喂养，食物等量，术前12小时禁食、水，术前1小时右小腿术区脱毛，动物均采用苯巴比妥（5mg/kg，肌注）及氯胺酮（2mg/kg，肌注）麻醉，术前半小时采用青霉素80万单位肌注，手术切开暴露实验犬右胫骨，于胫骨中断予以截断，分别在离截骨断端2cm、5cm处，于胫骨外侧使用2.5mm电钻钻孔4个，置钉位置骨折两端对称，由近端至远端分别标记为1～4。A组采用Ti2448半针固定，B组采用TAV半针固定，分别安装套夹及固定棒，复位骨折，对位满意。术后连续1周给予外固定半针针眼生理盐水冲洗，术后8周麻醉后处死实验犬取右侧胫骨备用。

1.2.3 实验资料收集

1.2.3.1 Micro-CT检查

术后8周，右侧胫骨取材后去除外固定套夹，截断裸露于骨质外的半固定半针，将胫骨制成含部分外固定半针的10mm骨段，取3号钉位的骨段做Micro-CT分析，通过10%的福尔马林溶液固定24～48小时后进行 Micro-CT（Explore Locus SP,GE,US）360°旋转连续扫描5小时成像，取以外固定半针为中心的直径6mm的圆柱状区域为兴趣区（range of interests, ROI），定义CT值高于1000为骨组织，对半针及螺纹周围的骨组织进行成像观察，并重建半针及螺纹周围的骨组织，分析骨密度（bone mineral density,BMD）、组织骨密度（tissue mineral density,TMD）、骨体积分数（bone volume fraction,BVF）及结构模型指数（structure model index,SMI）。

1.2.3.2 组织学检查

术后8周，同上方法，将胫骨制成含部分外固定半针的10mm骨段，放入100%丙酮、2%戊二醛中。病理切片标本经逐次脱水、塑料包埋，在Leica sp1600（Reichert-Jung,France）硬组织切片机上切成200 m厚的切片，制成不脱钙的病理切片，甲苯胺蓝染色后，观察半针螺纹周围的骨质情况。将部分标本小心旋出半针，骨段标本脱钙后行常规组织切片，改良的丽春红染色，观察骨组织及骨细胞形态。

1.2.4 数据分析

2 结果

所有实验动物全部存活，未出现骨折移位，2月后标本取材时见骨折均已愈合，未见植入物断裂及明显感染发生。

2.1 Micro-CT

通过对包含半针在内的骨组织标本进行Micro-CT连续360°旋转扫描，CT值高于1000定义为骨组织，定量分析结果以均数±标准差（±s）的形式表示，对骨密度（BMD）、组织骨密度（TMD）、骨体积分数（BVF）、结构模型指数（SMI）进行统计学研究。我们可以清楚地观察到2月时，A组和B组半针周围均已进行骨组织重建（图2a、b），肉眼可见Ti2448半针所在的骨髓腔内及皮质骨外缘骨质均明显多于TAV，这提示Ti2448半针所介导的生物力学环境更有利于骨细胞的增殖，统计学分析支持了这样的推论（表1）。我们对于ROI区域的骨质进行了CT数值重建，两组均可见骨质包绕半针全长进行了骨改建（图2c）。为了消除个体间皮质骨骨质量差异对Micro-CT统计数据的干扰，我们依据CT值的差异，对于钉道所在的骨质区进行了去皮质骨处理，即在Micro-CT上将皮质骨区域进行了数据遮盖（图2d），对术后2月新生的骨质进行统计分析研究，其结果再次证实，新生的骨质无论是骨量还是成骨质量，Ti2448-骨界面明显优于TAV-骨界面（表2）。（图2彩图见插页）

表1 半针周围ROI骨质分析（±s）

表1 半针周围ROI骨质分析（±s）

BMD(mg/cc)TMD(mg/cc) BVF SMI A组 170.4±7.2 638.0±28.5 0.7440±0.0344 6.749±0.611 B组 151.0±7.2 593.4±25.0 0.6720±0.0409 13.30±1.435 4.237 2.628 3.016 9.3910.003 0.031 0.017 0.000

表2 去皮质骨后半针周围ROI骨质分析（±s）

表2 去皮质骨后半针周围ROI骨质分析（±s）

BMD(mg/cc)TMD(mg/cc) BVF SMI A组 62.20±6.69 138.2±10.94 0.2280±0.0432 1.853±0.250 B组 45.00±7.25 95.80±7.19 0.1440±0.0261 1.374±0.169 4.355 7.242 3.720 3.5510.002 0.000 0.008 0.009

图2 术后2月，标本Micro-CT分析。a TAV半针形态良好，周围骨质形成；bTi2448周围骨质形成，较TAV周围明显增多，且孔隙率较小；c Micro-CT重建半针及ROI骨质；d对骨皮质进行数据覆盖，单独分析新生骨

2.2 组织学分析

术后2月硬组织切片，甲苯胺蓝染色显示两种半针周围骨质形成，Ti2448-骨界面骨质更加致密（图3a、b），因为硬组织切片厚度较大，镜下视野多为骨质重叠影像，遂对于部分取材标本，我们给予固定半针小心旋出后行常规切片，行改良的丽春红染色，切片提示Ti2448-骨界面骨质成熟且更加致密，Ti2448-骨界面镜下视野可见更多的骨组织细胞。Ti2448-骨界面的切片提示取出半针后可见钉道周围骨质存在破损现象，提示骨质与半针可能已进行良好的骨整合（图3c、d）（图3彩图见插页）。

图3 术后2月，标本进行组织学分析（×100）。a TAV钉骨界面硬组织切片甲苯胺蓝染色可见骨质包绕半针螺纹；b较TAV钉骨界面，Ti2448钉骨界面骨质更加致密，孔隙率更低；c去除半针后常规组织切片HE染色可见周围骨质逐渐形成；d较 TAV半针周围骨质，Ti2448周围骨质更多，表现更成熟

3 讨论

3.1 力与骨组织细胞之间的关系

Wolff于1892年提出著名的“Wolff定律”，即骨可能是兼具最大强度和最小质量的最佳力学结构[3]。1895年，Roux观察到特定的剪切力作用于间叶组织可以产生软骨，并基于此建立了细胞、骨塑性及组织分化的理论[4]。Pauwels于1980年在他的研究中写到，当应力改变时，骨小梁的结构排列和重新定向，似乎是骨构建原则下力学作用的结果[5]。在过去的一个多世纪里，生物力学前辈都在思考力与骨组织的关系，通过各种实验方法，得出了一些研究结论，比如：Pauwels的假说认为：偏应力可刺激纤维结缔组织的形成，而流体静力的压应力则可刺激软骨的形成。Clase等运用计算机有限元分析的方法对骨折愈合的组织分化模式和内植物-骨界面的结合进行了研究，并使用计算机模拟系统来预测组织分化的路径和过程[6]。这些都为我们了解组织与生物力学之间的关系打下基础，但是我们知道，细胞是构成组织成分的基本单元，力学刺激如何影响细胞功能，力学信号改变如何在分子生物学水平得以体现，不同力学属性的内植物材料具有不同的骨组织传导性或者骨组织诱导性的原因，过去我们常常把这种骨组织构建的差异归结于应力遮挡效应，但是其骨整合内在机制究竟是什么呢？或者说其骨细胞异常表达受什么因数所影响呢？Bonewald等认为骨形成及骨吸收的作用因素源于生物学因素的作用，即在骨吸收阶段，有某种细胞因子被释放，它们潜在的刺激了破骨细胞的形成[7]。而Huiskes等在2000年《Nature》上提出骨形成及骨吸收的作用因素源于生物力学因素在起作用，即围绕着吸收孔隙的局部应力集中，可能启动了来源于骨细胞网络中的信号，该信号刺激了骨形成[8]。另外一些学者对骨细胞如何感受外界力学因素，做了一些研究，Weinbaum等认为骨细胞可通过微小的流体剪应力感知体内已钙化的基质中的应变[9]，Jacobs等提出骨细胞作为力学感受器，主要感应流体脉动流量[10]。尽管这些研究尚未得到广泛认可，但是这为我们开启了新的研究思路，让我们学会借助力学生物学的理论和方法，从力学因数对组织细胞水平影响的研究出发，揭示力与骨相互作用的内在机制。本课题的研究正是基于此思路，从理论力学出发，通过应用不同力学属性的内植物材料，构建不同的微观力学环境，在细胞水平研究力学环境的改变对骨细胞的影响，与理论力学分析结果相对照，我们初步证实了在这两种材料所能提供的力学环境下，相对低位移的力学环境可能更有利于骨细胞的增殖和改建。但是，骨细胞如何感知相对位移，如何将物理信号转化为化学信号，有待于我们进一步研究力学信号与细胞分子生物学的关系。3.2 Micro-CT对于力学生物学研究的意义

Micro-CT是对骨科生物力学研究产生重大影响的技术发明，同时也是力学生物学宏观研究的重要工作，其空间分辨率达到100-1m，能够很好的用来对骨小梁结构及类骨小梁结构的新生骨进行3D的成像和测量。传统的双能X线吸收测量法（DEXA）常用于骨密度的检测，但骨的生物力学性能不仅取决于骨密度，还同时取决于骨质量、骨小梁的空间结构特性，Warden研究认为DEXA作为检测手段并不准确，在应力刺激下，BMD变化5%～8%，骨的力学效应将会变化60%[11]。采用Micro-CT分析骨组织技术，依据CT数值的变化，可以通过计算机软件对新生骨组织进行精确的分析，在我们的实验中，我们采用了Micro-CT对内植物及其钉骨界面骨组织进行了重建，对骨组织进行了统计分析，同时，为了避免个体皮质骨质量的差异对于新生骨统计数据的干扰，我们利用计算机软件对于皮质骨区域进行了数据覆盖，进而得到了单纯新生骨组织之间的对比分析结果，通过分析测量新生骨组织中的骨密度、组织骨密度、骨体积分数及结构模型指数，我们得出了Ti2448-骨界面的力学环境更有利于成骨，更有利于骨细胞的增殖。这与我们在硬组织切片及常规切片中所得出的细胞形态学结论是一致的。

本研究结果初步证实了 Ti2448-骨界面相比 TAV-骨界面，具有更低的相对位移特性，这种特性可能有利于骨组织细胞的矿化，我们认为钛合金-骨界面的相对位移可能影响骨细胞功能，这与国外学者Skerry等的研究在某些方面一致，他们的研究指出：体内骨细胞的酶活动随骨承受的负荷而增加，增加的大小与骨组织产生的应变存在相关性[12]。尽管本实验得出了低相对位移界面可能更有利于骨细胞功能的结论，但是低相对位移界面所介导的力学环境如何影响骨组织细胞，其分子生物学机制仍不清楚，这需要更多的研究去探索。

[1] 戴尅戎.力学生物学在骨与软骨研究中的应用.中华骨科杂志. 2006，26（6）：429-431.

[2] 郑凯，于秀淳，郭征，等.生物金属材料在骨科的应用及发展.生物骨科材料与临床研究，2013，10（2）：31-33.

[3] Wolff J.The law of bone remodeling[translation of wolff,1892]. Berlin:Springer-Verlag,1986:126.

[4]Van C Mow,Rik Huiskes.骨科生物力学暨力学生物学.汤亭亭，裴国献，李旭，等译.济南：山东科学技术出版社，2009：19-20.

[5] Pauwels F.Biomechanics of the locomotor apparatus[translation of Pauwels,1973].Berlin:Springer-Verlag,1980:518.

[6] Clase LE,Heigele CA.Magnitudes of local stress and strain along bony surfaces predict the course and type of fracture healing.J Biomech,1999,32（3）:255-266.

[7] Bonewald LF,Mundy GR.Role of transforming growth factorbeta in bone remodeling.Clin Orthop Relat Res,1990,（250）: 261-276.

[8] Huiskes R,Ruimerman R,van Lenthe GH,et al.Effects of mechanical forces on maintenance and adaptation of form in trabecular bone.Nature,2000,405（6787）:704-706.

[9] Weinbaum S,Cowin SC,Zeng Y.A model for the excitation of osteocytes by mechanical loading-induced bone fluid shear stresses.J Biomech,1994,27（3）:339-360.

[10]Jacobs CR,Yellowley CE,Davis BR,et al.Differential effect of steady versus oscillating flow on bone cells.J Biomech,1998,31（11）:969-976.

[11]Warden SJ,Hurst JA,Sanders MS,et al.Bone adaptation to a mechanical loading program significantly increases skeletal fatigue resistance.J Bone Miner Res,2005,20（5）:809-8l6.

[12]Skerry TM,Bitensky L,Chayen J,et al.Early strain-related changes in enzyme activity in osteocytes following bone loading in vivo.J Bone Miner Res,1989,4（5）:783-788.

【作者按】

1.这篇文章的思路是对力学生物学研究的探索，而不是传统的生物力学的研究思路，更不是只为了证实低弹性模量外固定系统的生物力学优势。力学生物学是一个比较新的概念，很多人认为就是生物力学，其实是不对的，它们某些研究方法或许存在交叉，但是看问题以及解释问题的角度是完全不一样的。在这篇文章里，我们是利用不同的固定物构建不同的力学环境，研究力学环境对细胞生物学的影响，而不是为了做一个简单的生物力学实验。

2.可能会有审稿专家提出：力学模型与实验模型有很大的区别，这里设计的力学模型简单，不反映实际情况。我们是这样认为的，我们构建的力学模型，是借助物理力学的思想，在模型中提到的作用力，并不是特指某一个力学载荷，它可以是压力，可以是弯曲应力，可以是扭转应力，也可以是牵拉力，这个力的存在是为了达到构建界面微形变的目的，因为任何力作用于材料都必然产生形变，进而利用数学微积分的思想进行分析，它并不反映真实的骨受力情况，骨的受力情况异常复杂，不是一个模型能够完美模拟的，即使较为流行的有限元分析，也不可能，因为接触力学是物理力学的顶尖难度问题，目前还没有很好的理论能够用于完美阐释接触力学，更谈不上构建骨的生物力学环境了。因此，我们的思路是通过引进作用力的力学变量，推导形变与材料的关系，完成第一部分实验。第二部分，将材料与细胞行为学相联系，进行实现形变-材料-骨细胞整体关联性，从而间接阐释形变与骨细胞行为之间的关系。

3.这篇文章是前面研究的延续，可能有些结论单纯看这一篇文章有些草率，可以参考本课题组既往的研究，低弹性模量外固定系统对股骨干骨折模型的生物力学研究.中华创伤骨科杂志.2010，12（1）:61-65；Zheng K,Li X,Guo Z,et al.Effects of Ti2448 half-pin with low elastic modulus on pin loosening in unilateral external fixation.J Mater Sci Mater Med,2011,1,22（6）:1579-88.

Mechanobiological studies about two kinds of bone-titanium alloy interface

ObjectiveTo investigate the mechanobiological osteocyte biological behaviour for bone interface between two kinds of titanium alloy.MethodsMechanical model was established by bolt and nut interaction under force,analysis of bone interface mechanical properties changes under different titanium alloys.Micro-CT analysis and tissue sections have been used for observing the osteocyte biological behavior around bone-titanium alloy interface in experimental animals.ResultsIn the bone-titanium alloy interface mechanics model theory and analysis,compared to bone-Ti2448 interface,bone-TAV interface relative displacement is approximately1.8times.The results of animal experiments suggested that the bone mineral content and bone quality are better around bone-Ti2448 interface than bone-TAV interface.ConclusionSmaller relative displacement is conducive to interface osteocyte proliferation in bone-titanium alloy interface. Reducing the modulus of elasticity of material is an effective method,maybe,it is a possible option for the better interface healing.

Bone-titanium alloy interface;Mechanobiology;Relative displacement;Elastic modulus

R318.01 [

]A

郑凯（1986-）男，硕士，主治医师。研究方向：生物金属材料，关节外科。

*[通讯作者]于秀淳（1965-）男，博士，教授，主任医师。研究方向：骨病，骨肿瘤，脊柱疾病。

]郭征（1965年-）男，博士，教授，主任医师。研究方向：骨肿瘤，骨科材料。

2013-07-02）

国家高技术研究发展计划(863计划)课题（2007AA03Z431）

1山东济南解放军济南军区总医院骨病科，山东济南250031；2陕西西安解放军第四军医大学西京医院骨科，陕西西安710032

*[