短时授精后受精率高与受精完全失败后早补救患者的临床结局和精子参数分析*

周 亮 王锦凤 肖 露 王 勇 耿 岚 郝桂琴 张 秦 石江霞 钱卫平

北京大学深圳医院生殖医学科（深圳 518036）

短时授精后受精率高与受精完全失败后早补救患者的临床结局和精子参数分析*

周 亮 王锦凤 肖 露 王 勇 耿 岚 郝桂琴 张 秦 石江霞 钱卫平**

北京大学深圳医院生殖医学科（深圳 518036）

目的分析体外授精（IVF）短时授精中受精率高（受精率＞60%）与受精完全失败（受精率=0%）早补救卵母细胞胞浆内单精子注射（ICSI）患者的临床结局和精子参数，探讨IVF失败的相关因素。方法对比322例IVF短时授精周期中153例受精率达到60%以上的患者（受精率高组即 A组）与同期接受IVF短时授精发现受精完全失败后进行早补救ICSI治疗的53名患者（受精完全失败组即B组）的临床结局及其精子参数。结果A组与B组各获卵1 619和393枚，各有133名和47名患者接受了新鲜胚胎移植。两组间的正常卵裂率分别为98.02%（940/959）和97.70%（254/260），优质胚胎率分别为33.51%（315/940）和35.43%（90/254），平均移植胚胎数分别为2.15±0.39和2.05±0.52，移植日内膜厚度分别为（12.99±2.53）mm和（12.38±2.45）mm，胚胎种植率分别为29.41%（85/289）和24.73%（23/93），临床妊娠率分别为44.36%（59/133）和42.55%（20/47），流产率分别为2.26%（3/133）和2.13%（1/47），继续妊娠率分别为41.35%（55/133）和38.30%（18/47），差异均无统计学意义。而A组的正常受精率较B组低[65.55%（959/1463）vs 77.61%（260/335）]，同时多原核受精率较B组高[14.56%（213/1463）vs 6.27%（21/335）]，差异均具有统计学意义。A组与B组平均精子密度分别为（74.63±36.05）×106/ mL和（76.97±36.64）×106/mL，前向精子密度分别为（46.02±13.79）×106/mL和（40.63±16.08）×106/mL，正常形态精子分别为（3.74±1.73）%和（4.21±1.86）%，顶体酶活性分别为（79.18±24.89）uIU和（71.81±32.30）uIU，均存在一定的差异，但是并无统计学意义。结论 短时授精后受精率高与受精完全失败行早补救患者具有接近的临床妊娠率，但受精率高组较受精失败行早补救组具有更高的多原核受精率和更低的正常受精率，前向精子密度和精子形态对受精有重要影响，但是其对受精失败的预测作用有限。

精子注射, 细胞质内; 妊娠结局; 精子

常规体外授精（in vitro fertilization, IVF）周期中完全失败的发生率约为5%～10%[1,2]，给医患双方带来巨大的精神压力和经济困难。IVF短时授精结合早补救卵母细胞胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）方案的实施能在IVF受精完全失败后挽救该治疗周期，并取得较好的妊娠结局，所以逐渐被广泛应用。

在IVF短时授精早期拆颗粒细胞后，IVF实验室工作人员能遇到多种情况，最常见的是可见部分两极体受精卵，表明部分卵母细胞受精了，而进行早补救ICSI的患者往往在早拆颗粒细胞后，观察不到任何卵母细胞具有两极体，表明可能IVF完全失败。本中心进行IVF短时授精治疗的患者一般是不孕年限超过4年，或精子密度处于（5～30）×106/mL范围内，或正常精子形态少于4%，为避免IVF完全失败而行短时授精方案，现回顾性分析短时授精后受精率高（受精＞60%）与受精完全失败患者的临床结局和精子参数，希望从临床上寻找与受精失败相关的因素，既能避免受精完全失败又能防止过度治疗。

资料与方法

一、研究对象与分组

回顾性分析2013年1月1日至2014年5月30日期间于我院生殖中心接受IVF短时授精且受精率＞60%的153个周期（A组）和53个短时授精完全失败早补救ICSI周期（B组）的临床结局和精子参数。患者女方的不孕年限超过4年，或精子密度处于（5～30）× 106/mL范围内，或正常精子形态少于4%。两组间患者双方的年龄、不孕年限、用药天数均无统计学差异。助孕前，精液检查采用WHO精液分析方法进行2次及以上分析，结果判断以WHO检测手册（第五版）为准。IVF短时授精方案是于精卵共孵育4～6h后拆卵并观察第二极体排出情况，在精卵共孵育16～18h观察记录原核情况。A组和B组各有133名和47名患者接受了新鲜胚胎移植。

二、方法

（一）促排方案

患者前一月经周期第21天左右给予促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin releasing hormone agonist, GnRH-a，博福-益普生制药有限公司，3.75mg/瓶）1.25mg 进行肌肉注射，根据患者年龄和双侧卵巢基础窦卵泡数，在月经第4～6d开始给予促性腺激素（gonadotropin, Gn）果纳酚（默克雪兰诺有限公司，75 IU/支）2～6支/d。，当2个或2个以上卵泡直径达18mm时，肌注人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrop, HCG，丽珠集团丽珠制药厂，2000IU/瓶）10000IU，36～38h后经阴道B超指引下取卵。

（二）常规精液分析和形态学检查

禁欲3～7d后手淫取精，用Markler计数板进行精液常规分析，用Diff-Quick法分析精子形态，采用改良Kennedy法检测顶体酶活性。

（三）精液处理与体外授精

术前禁欲3～7d，取卵当日男方以手淫法取精，液化后采用密度梯度离心法+上游法优化精子，加精比例为2～4万条精子/卵。

（四）授精观察

在精卵共孵育4h后拆去卵周的颗粒细胞并移至新的培养滴，观察卵是否成熟，是否具有两极体，卵胞浆形态等[3]。如4h后观察到有部分卵子具有双极体，将其继续培养至16～18h后观察记录原核情况。如4h未观察到双极体，于6h再进行观察，如发现有受精卵具有双极体则继续培养，如仍未观察到卵子具有双极体就对所有MII卵子实施早补救ICSI并记录在案。

（五）原核期和卵裂期胚胎观察

精卵共孵育16～18h后（即取卵后第一天）将胚胎移入卵裂微滴，进行原核观察，看到两个清楚的原核即为正常受精，异常受精包括观察到1个原核和3个或以上的原核，未观察到原核作为未受精记录。取卵后第三天观察卵裂情况，按卵裂期胚胎评分标准评分，主要记录胚胎细胞数、碎片率和卵裂球大小是否均等。优质胚胎的定义为取卵后第三天为7～9个卵裂球，大小基本均等，碎片率低于10%。取卵后第三天行新鲜胚胎移植，根据形态学标准选取2～3个最优胚胎进行移植。

（六）确定临床结局

移植胚胎14d后行血HCG检测，结果为阳性者于移植后35d行B超检查，如有孕囊即诊断为临床妊娠。临床妊娠率=临床妊娠周期数/新鲜移植周期数×100%；胚胎种植率=B超下观察到的孕囊数/移植胚胎数×100%。

（七）统计学分析

应用SPSS17.0统计软件中卡方检验和独立样本t检验进行统计分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、一般资料及精子参数比较

共纳入对象206例（A组153例，B组53例），其中共计180例行新鲜胚胎移植（A组133例，B组47例）。两组患者的年龄、不孕年限、基础卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone: FSH）、基础黄体生成素（luteotropic hormone: LH）、基础雌二醇（Estradiol：E2）、用药天数、HCG日FSH、HCG日LH、HCG日E2、移植胚胎数和移植日内膜厚度均无统计学差异（P＞0.05），见表1。

表1 两组一般情况及妊娠结局分析

二、受精情况、胚胎质量和妊娠结局比较

A组和B组各获卵分别为1 916和393枚，正常受精（2原核）率分别为65.55%和77.61%，多原核受精率分别为14.56%和6.27%，正常卵裂率分别为98.02%和97.69%，优质胚胎率分别为33.51%和35.43%。A组和B组分别有133名和47名患者接受了新鲜胚胎移植，胚胎种植率分别为29.41%和24.73%，临床妊娠率分别为44.36%和42.55%，流产率分别为2.26%和2.13%，宫外孕率分别为0.85%和 2.13%，继续妊娠率分别为41.35%和38.30%。其中A组的正常受精率较B组低，但多原核受精率较B组高，差异具有统计学意义（P＜0.05），其他比较均无统计学差异，见表1。

三、精子参数分析

A组和B组男方平均年龄分别为（34.62± 5.17）岁和（33.84±4.17）岁，平均精子密度分别为（74.63±36.05）×106/mL 和（76.97±36.64）× 106/mL，前向精子密度分别为（46.02±13.79）× 106/mL和（40.63±16.08）×106/mL，正常形态精子百分率分别为3.74 %和4.21%，顶体酶活性分别为（79.18±24.89）uIU和（71.81±32.30）uIU。A组具有更高的前向精子密度，但是两组比较并无统计学差异；两组间的正常精子形态和顶体酶活性也无显著差异，见表2。

表2 两组精子参数分析（±s）

表2 两组精子参数分析（±s）

t值P值男方年龄(岁) 34.62±5.17 33.84±4.17 0.76 0.45精液量(mL) 3.43±1.25 3.25±1.38 0.73 0.46精子密度(106/mL) 74.63±36.05 76.97±36.64 -0.34 0.74前向精子密度(106/mL) 46.02±13.79 40.63±16.08 1.95 0.053正常精子形态(%) 3.74±1.73 4.21±1.86 -1.37 0.17顶体酶活性(uIU/106） 79.18±24.89 71.81±32.30 1.25 0.22

讨 论

IVF短时授精是指授精后早期将受精卵从精卵共孵育液中移出，拆除颗粒细胞观察卵母细胞是否具有双极体并以此推断其受精与否，因该技术能成功避免完全受精失败，同时并没扩大ICSI指征，所以在业内大受欢迎。也有研究表明短时授精较常规IVF授精可以使受精卵免受高活性氧（reactive oxygen species, ROS）的影响而提高胚胎质量[4,5]。本研究也表明短时授精能避免受精障碍患者IVF失败并获得良好的临床结局。

一、 短时授精增加IVF受精无障碍患者的多原核受精率

伴随着短时授精技术的广泛使用，在IVF实验室会遇到了各种不同情况，部分患者短时授精完全失败，这部分患者是短时授精早补救ICSI技术的得益者，从以上的数据分析结果可知，早补救后的受精率、正常受精率、卵裂率、优质胚胎率，临床妊娠率都具有较满意的效果，同时其多原核受精率，流产率和异位妊娠率也在较低的水平[6]。在应用短时授精技术时，还遇到部分患者，其实际受精能力本无障碍，短时授精早拆颗粒细胞后无需补救ICSI，从上面的数据分析结果可知，这部分患者同样具有较满意的正常卵裂率和优质胚胎率、临床妊娠率和继续妊娠率，但是本研究结果表明其多原核受精率达14.56%，显著高于受精失败早补救ICSI组，其原因是否与短时授精早期拆颗粒细胞操作相关尚不明了。

二 、精子参数对IVF短时授精结果的预测能力有限

为了既能避免完全受精失败，又能不过度进行短时授精早拆颗粒细胞，本研究对比分析了短时受精率高组和完全失败组的各种精子参数，期望能寻到一定的线索指导临床工作，研究的结果显示两组间精子密度和总精子数均相当，A组的前向精子数较受精失败组高，但是并无统计学差异；两组间的正常精子形态百分率和顶体酶活性也无显著差异。在临床工作中，精子正常形态百分率和顶体酶活性仍是一个重要的推测受精能力的指标，但是就个体而言，仍有患者具有较高精子正常形态百分率和顶体酶活性仍然受精完全失败，同时又有部分患者实际受精无障碍但是其精子正常形态和顶体酶活性检测结果数值较低。

哺乳动物的自然受精是一个精密而复杂的生理过程，它包括了精卵识别、顶体反应、精子穿过透明带、精卵质膜结合、卵子皮质反应和雌雄原核形成等一系列的重要步骤，任何一个环节出现问题都可能引起IVF受精失败[7,8]。在辅助生殖技术治疗过程中，精子质量参数具有重要的预测受精能力的作用，但是在常规IVF授精和IVF短时授精间界定出明确的界限和指标需要更大样本量的分析，也是业界的目标和努力的方向。

1 Mahutte NG, Arici A. Failed fertilization: is it predictable?.Curr Opin Obstet Gynecol2013; 15(3): 211-218

2 Kuczynski W, Dhont M, Grygoruk C,et a1. Rescue ICSI of un-fertilized oocytes after IVF.Hum Reprod2002; 17(9): 2423-2427

3 黄国宁, 孙海翔. 体外受精-胚胎移植实验室技术. 北京:人民卫生出版社, 2012: 95-115, 163-175

4 Gianaroli L, Fiorentino A, Magli MC,et al.Prolonged sperm-oocyte exposure and high sperm concentration affect human embryo viability and pregnancy rate.Hum Reprod1996; 11(11): 2507-2511

5 Kattera S, Chen C. Short co-incubation of gametes in in vitro fertilization improves implantation and pregnancy rates: a prospective, randomized, controlled study.Fertil Steril2003; 80(4): 1017-1021

6 Liu W, Liu J, Zhang X,et al. Short co-incubation of gametes combined with early rescue ICSI: an optimal strategy for complete fertilization failure after IVF.Hum Fertil (Camb)2014; 17(1): 50-55

7 Vogiatzi P1, Chrelias C, Cahill DJ,et al. Hemizona assay and sperm penetration assay in the prediction of IVF outcome: a systematic review.Biomed Res Int2013; 2013: 945825

8 Katsoff B, Check JH, Mitchell-Williams J. Defective oocytes are not a common cause of unexplained infertility as determined by evaluation of sharing oocytes between infertile donors and recipients.Clin Exp Obstet Gynecol2013; 40(2): 193-195

（2014-08-01收稿）

Clinical outcomes and sperm parameter analysis between patients with high fertilization rate and complete fertilization failure after short co-incubation of gametes combined with early rescue ICSI*

Zhou Liang, Wang Jingfeng, Xiao Lu, Wang Yong, Geng Lan, Hao Guiqing, Zhang Qin, Shi Jiangxia, Qian Weiping**
Department of Reproductive Medicine, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong, China

ObjectiveTo analyze the clinical outcomes and sperm parameters of patents after short co-incubation of gametes combined with early rescue ICSI, and investigate the causes of complete fertilization failure.MethodsAmong 322 short co-incubation of gametes cycles, 153 cases had high fertilization rate (IVF fertilization rate>60%: Group A) and 53 cases had complete un-fertilization and rescued by early ICSI (IVF fertilization rate=0%: Group B). The clinical outcomes and sperm parameters were comparatively analyzed between above two groups.ResultsThe patients in Group A and Group B received (1916 vs 393) eggs, and 133 and 47 patients accepted embryo-transfer in their freshcycles, respectively. There were no signif cant differences in the rates of cleavage[98.02%(940/959)vs 97.70%(254/260)], good quality embryo[33.51%(315/940)vs 35.43%(90/254)], implantation[29.41%(85/289)vs 24.73%(23/93)], clinical pregnancy[44.36%(59/133)vs 42.55%(20/47)], abortion[2.26%(3/133)vs 2.13%(1/47)] and ongoing pregnancy[41.35%(55/ 133)vs 38.30%(18/47)] between two groups. The normal fertilization (2PN) rate in Group A was signif cant lower than that in Group B, and the polyspermy rate was signif cant higher than that in GroupB. The average sperm density (74.63×106/ mL vs 76.97×106/mL), forward movement sperm density (46.02×106vs 40.63×106), normal sperm morphology (3.74% vs 4.21%) and acrosin (79.18 vs 71.81) were difference between above two groups, but the difference was not signif cant.ConclusionThe patients in Group A and Group B presented similar clinical pregnancy rates, but the patients in Group A had higher polyspermy rate and lower normal fertilization (2PN) rate. Forward movement sperm density and sperm morphology showed some effects on fertilization, but accurate prediction of fertilization failure by sperm parameters still needs to be further investigated.

sperm injections, intracytoplasmic; pregnancy outcome; spermatozoa

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.10.006

R321-33

资助: 为国家自然科学基金资助（30900817）；深圳市科技计划项目资助（201302069, JCYJ20120618, ZYC201006180435A）
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, E-mail: qianweiping2014@163.com