辣椒疫霉菌拮抗细菌的筛选、鉴定及防效测定

孙冰冰，段红英，李伟，魏军，田涛*

(1.天津市农业科学院植物保护研究所，天津 300381;2.天津市西青区植物保护站，天津 300380)

辣椒疫病，是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的一种毁灭性的土传病害，在全球范围内的热带、亚热带及温带地区的露地和保护地均有发生［1－2］。我国自从50年代在江苏报道此病的发生后，其发生和为害有逐渐加重的趋势，常导致植株成片死亡，发病地块一般病株率为20%左右，严重的达到80%以上［3］。目前尚无对辣椒疫病有效防治的抗病品种，生产上防治主要是以化学药剂为主。但由于长期大量使用杀菌剂，P.capsici已对大多数常用农药品种产生了不同程度的抗药性［4］。另外，由于土壤吸附和微生物降解作用，使用化学农药防治辣椒疫病效果不佳。由于该病的循环周期非常短(仅3～5 d)，病害的传播速度也非常快。这些原因造成生产中化学农药的大量、高频使用，带来严重的环境和农产品中农药残留问题［5］。

由于利用自然界有益微生物防治土传病害具有安全性和有效性方面所具有的天然优势，因此利用有益微生物对辣椒疫病进行生物防治成为重要的研究方向。我国已报道的生防菌主要有芽孢杆菌、放线菌、木霉、曲霉等［1－3，5－8］。国外有 Quantum 4000、BIBAB－T、AmniteA－100、Biologic－SC27 等细菌类和真菌类生防产品作为杀菌剂或生物肥料注册登记［5］。本研究中，利用了单一靶标初筛－多靶标复筛－室内生测的筛选体系从来自全国多个地区的根际土壤中筛选出对辣椒疫病防病效果达到70%以上的6个候选生防菌株，其中TB1340防效达到82%。结合16S rRNA基因序列测序鉴定和形态学观察，TB1340被初步鉴定为Bacillus sp.。

1 材料与方法

1.1 供试菌株、培养基及辣椒品种

辣椒疫霉(Phytophtora capsici)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)及瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)为天津市植物保护研究所植物病害生物防治研究室保存。

LB培养基用于拮抗细菌的分离培养。PDA培养基用于4种病原菌的培养以及拮抗细菌的筛选。几丁质培养基(胶状几丁质 15 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO40.7 g，KH2PO40.3 g、琼脂20 g，定容至1000mL，pH值7.0～7.2)用于几丁质酶的检测。纤维素酶培养基(蛋白胨10 g，酵母粉5 g，羧甲基纤维素钠10 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，琼脂20 g，定容至1000mL，pH 值 7.0)用于纤维素酶的检测。β－1，3－葡聚糖酶培养基(蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 5 g，刚果红 0.04g，琼脂 20 g，定容至 1000mL，pH 值7.0)

供试辣椒品种:红线椒8819(对辣椒疫病中等抗性)，天津科润种业有限公司提供。

1.2 拮抗细菌的分离、纯化与保存

从天津、河北、山东、山西、福建、河南及江苏等全国多个地区采集土样56份(选取植物根围1～2 mm土壤)，采用土壤稀释法于LB培养基上分离培养细菌，选择合适的稀释浓度(每个平皿出现大约200个菌落)。从每个平皿上选择10个左右菌落形态有差异的菌株经平板划线纯化，转移到加20%甘油的EP管里面，－20℃保存。

1.3 拮抗细菌的筛选

采用平板对峙法，用直径7 mm的打孔器取生长旺盛的病原菌菌饼转接于PDA平板中央，视病原真菌生长速度选择合适时期接种分离到的细菌(腐霉和立枯丝核菌与细菌同时接种，疫霉和灰霉待菌丝扩增1 cm后再接种待测细菌)。接种时用高温灭菌的牙签蘸取分离到的细菌，等距离(距离病原菌3 cm处)对称点接到PDA平板上，于25℃恒温培养，待对照皿中真菌菌丝即将长满皿时测量抑菌圈大小，根据抑菌圈大小筛选出对病原菌具有较强拮抗作用的菌株。

1.4 室内防治效果测定

选择大小均匀的辣椒种子经消毒后，用灭菌水浸泡4 h，于28℃催芽播种至露白。然后用含有1.0×108cfu/mL待测菌悬液浸种45 min。将4粒种子放入装有灭菌土的营养钵里，待幼苗长至3～4叶期时留两株长势均匀的幼苗，每个处理20盆，3次重复。将病原菌P.capsici用CA培养基在25℃培养10 d后，诱导出游动孢子，用无菌水将游动孢子浓度调整为1.0×105cfu/mL。在距离植株3 cm处将5mL游动孢子悬浮液注入植株根部。置于28℃光照培养箱培养，分别于7、14、21 d后调查植株萎蔫或死苗情况(病株数)［9］。

1.5 菌株生物学特性测定

几丁质酶活性检测:将待测菌株接种在含有胶体几丁质的几丁质酶检测培养基［10］上，经37℃过夜培养后，在4℃放置7 d后检测菌落边缘形成的透明圈宽度。纤维素酶活性检测:将待测菌株接种在含有羧甲基纤维素钠的纤维素酶检测培养基［11］上，经37℃过夜培养后，在25℃放置1 d后经染色处理，观测在菌落边缘是否形成透明圈及其宽度。β－1，3－葡聚糖酶活性检测:将待测菌株接种在含有刚果红的葡聚糖酶检测培养基［12］上，经37℃过夜培养后，在25℃放置1 d后，观察菌落周围的培养基颜色变化。

1.6 菌株分类地位的16S rRNA序列测定

按常规小量细菌基因组提取方法提取制备样品［13］，根据细菌16S rRNA基因序列的保守区域设计引物:16sF－AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT 和 16sR－TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC。 把 用PCR扩增得到的片段连接到 pUC－T载体(康为世纪)，转化大肠杆菌Escherichia coli DH5α菌株，筛选阳性转化子，送金唯智生物科技公司进行序列测定。将得到的序列与其他细菌来源的16S rRNA基因序列进行比对(MEGA)，分析其亲缘关系。

1.7 数据处理

利用DPS软件中的Duncan′s新复极差法进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 生防菌的分离与初步筛选

依照材料与方法所述，从来源于全国各地的56份样品中分离菌株，建成库容为10000株的菌株资源库。以P.capsici为靶标进行平板拮抗实验，初步得到802株对P.capsici具有拮抗作用的生防菌候选菌株，其抑菌圈宽度为2～16 mm。用初筛得到的菌株对R.solani、B.cinerea及P.aphanidermatum进行平板拮抗试验，得到62株对4种病原真菌均具有较好拮抗作用或对3种具有很强拮抗作用的候选生防菌株(表1)，命名为 TB－1301 ～TB－1362。

表1 候选生防菌株对4种植物病原真菌的拮抗能力测定Table 1 Antagonistic capability determination of biocontrol candidates against four kinds of phytopathogenic fungi

续表1

2.2 室内盆栽测定对辣椒疫病防治效果

从62株候选生防菌中挑选出对4种病原菌均具有良好拮抗效果的29个菌株进行室内盆栽试验，以测定其对辣椒疫病的防治效果。在接种病原菌后7、14和21 d调查植株发病情况，结果表明在既不接种病原菌也不接种生防菌的处理中(CK1)，没有植株发病;在只接病原菌，不接种生防菌的处理中(CK2)，植株全部发病;在同时接种病原菌和生防菌的各个处理与CK2相比，其发病率均在不同程度表现出下降的趋势，在21 d后菌株TB1307、TB1308、TB1314、TB1340、TB1344和TB1358相对防治效率仍达到70%以上，其中菌株TB1340防效最好，在接种病原菌后7、14和21 d调查，其相对防效分别为100%、90%和82%(表2)。

表2 拮抗菌株对辣椒疫病盆栽的防治效果Table 2 Control effects of antagonistic strain against pepper phytophthora blight in pot experiment

续表2

2.3 菌株TB1340基本生物学特性

菌株TB1340在LB固体培养基上经37℃培养16 h后，经肉眼观察其菌落为圆形，中间稍微隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，呈白色半透明状(图1A);将菌株TB1340接种在含有胶体几丁质的几丁质酶检测培养基上，经37℃过夜培养后，在4℃放置7 d后在菌落边缘形成宽度约3 mm的透明圈(图1B);将菌株TB1340接种在含有羧甲基纤维素钠的纤维素酶检测培养基上，经37℃过夜培养后，在25℃放置1 d后经染色处理，在菌落边缘观测到宽度约20mm的透明圈(图1C);将菌株TB1340接种在含有刚果红的葡聚糖酶检测培养基上，经37℃过夜培养后，在25℃放置1 d后，在菌落周围的培养基颜色明显变浅(图1D);

图1 菌株TB1340基本生物学特性Fig.1 The basic biological characteristics of strain TB1340

2.4 菌株TB1340种属16S rRNA基因序列测定

将菌株TB1340提取基因组DNA后，扩增其16S rRNA基因序列，测序并将TB1340的16S rRNA基因序列上传 GenBank，其 GenBank登录号为 KJ501094。序列比对分析表明，该菌和解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens菌株Hk8－20以及枯草芽孢杆菌B.subtilis菌株CZB13同源性最高，达到97.89%。另外，与菌株甲基营养型芽孢杆菌B.methylotrophicus相比其同源性也达到97.08%。将菌株TB1340的16S rRNA基因序列与高同源性的B.amyloliquefaciens、B.subtilis的序列以及花域芽孢杆菌B.vallismortis、鲁菲不动杆菌Acinetobacter lwoffii、蜡样芽孢杆菌B.cereus等菌株的序列比对，构建系统发育树(图2)。菌株TB1340与12株B.amyloliquefaciens、3株 B.subtilis及2株B.methylotrophicus聚在一起形成1个分支。结合菌株TB1340的16S rRNA基因序列测定和其形态特征(图1A)，将其确定为Bacillus sp.，但最终分类地位仍需进一步生理生化验证。

图2 菌株TB1340的16S rRNA区域的进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of 16S rRNA area of strain TB1340

3 讨论

我国幅员辽阔，不同的地方气候条件和地形地貌差异较大，造就了丰富的微生物资源。如何更好地开发和利用自然界中的有益微生物防治植物病害是一个重要的科学问题。为了更为高效地筛选植物病害生物防治菌株，科研工作者进行了多种尝试。有研究者利用分子生物学和生物化学手段建立高通量的筛选体系［14－16］;有研究者采取从沙漠、高原、极地和滩涂筛选生防菌株的策略［2，11，16］。在本研究中，为了发掘我国的微生物资源，并且从微生物和植物互作的角度考虑，采用了从多个省份选取长势较好的农作物根围分离和筛选生防菌株的策略，建立了库容为10000株的微生物资源库。以P.capsici为靶标，利用平板拮抗的方法从中筛选出802株对P.capsici具有较好拮抗效果的菌株。

与化学药剂相比，植病生防产品在防治范围上较窄，这是影响植物病害生物防治产品推广的一个限制性因素。为了尽可能地获得较为广谱的候选生防菌株，同时出于减少在防病效果生物学测定的工作量考虑，又以R.solani、B.cinerea及P.aphanidermatum为靶标对候选生防菌株的拮抗能力进行检测，确定了62株对4种病原真菌具有较强拮抗能力或对3种真菌具有很强拮抗能力的菌株。经温室盆栽实验测定，有6株候选菌株防效达到70%以上，其中TB1340菌株防效达到82%，表现出良好的应用前景，但是其田间使用效果以及对其他病害的防治效果尚需进一步地验证。

生防菌所产生的抗生素类、脂肽类、几丁质酶、纤维素酶和β－1，3葡聚糖酶等物质是其抑菌和防病的关键因子［10，17］，几丁质酶、纤维素酶和 β－1，3 葡聚糖酶是多种芽孢杆菌类生防菌株的关键生防因子［10，12］。用几丁质酶、纤维素酶和β－1，3葡聚糖酶鉴别培养基检测菌株TB1340产酶情况时，发现其产生这3种酶的能力都比较强(图1)。将菌株TB1340产酶能力和其广谱的抑菌能力相联系，我们进一步思考:(1)如何将几丁质酶、纤维素酶和β－1，3葡聚糖酶作为指标，纳入科学的筛选评价体系从而提高生防菌的筛选效率;(2)这3种酶对菌株TB1340针对不同的病原真菌的拮抗和生防能力的贡献是否相同，如果不同，这种差异具有怎样的普遍规律。这些有待于进行更加深入地研究。

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