拮抗性多粘类芽孢杆菌PB-2及其制剂对葡萄霜霉病的防效测定

扈进冬，吴远征，李纪顺，魏艳丽，陈泉，杨合同，2

(1.山东省科学院生物技术研究中心，山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250014;2.山东理工大学生命科学学院，山东 淄博 255049)

葡萄霜霉病是由葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)引起的一种在世界范围内影响葡萄种植的重要病害，严重危害葡萄的叶片和嫩梢，影响葡萄生长和产量。目前防治霜霉病所用药剂大都是人工合成化学农药，如安泰生可湿性粉剂、甲霜灵锰锌、霜疫必克、瑞毒霉、霜霉威和烯酰吗啉等等。生物防治可以利用有益微生物和其代谢产物对植物病害进行有效的防治，近些年来，在国家的大力支持和鼓励下，已有多种生防菌剂在国内得到广泛应用。［1－3］

拮抗性多粘类芽孢杆菌PB-2是山东省科学院生物研究所新近从发生黄瓜霜霉病的蔬菜大棚中筛选的一株生防菌，对多种病原真菌均具有良好的拮抗作用，是一株广谱拮抗菌，经鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，对其抗菌物质进行分离纯化，分析为多肽类抗菌物质。此外，该菌株还胞外分泌β-1，3-葡聚糖酶、β-1，4-葡聚糖酶和蛋白酶等胞壁降解酶，通过叶盘漂浮法的室内测定发现其对葡萄霜霉病菌有较好的防治效果。本文通过田间试验初步研究了拮抗性多粘类芽孢杆菌PB-2在大田环境下对葡萄霜霉病的防治效果，为进一步开发利用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

拮抗性多粘类芽孢杆菌PB-2、LTR-2为本实验室保存木霉生防菌株，对多种真菌病害均有良好的防治效果;受试葡萄品种为“玫瑰香”。拮抗性多粘类芽孢杆菌PB-2保存采用改良的NA培养基:牛肉膏4.0 g/L，蛋白胨11.0 g/L，氯化钠0.5 g/L，琼脂15 g/L，pH值为7.0。拮抗性多粘类芽孢杆菌发酵液:豆饼粉5%，玉米粉2%，碳酸钙0.1%，硫酸镁0.05%，硫酸铵0.2%，pH值为7.0。LTR-2发酵选用PDA培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 PB-2及其无菌滤液对葡萄霜霉病菌抑制作用

因葡萄霜霉病菌只能活体培养，故采用叶盘漂浮法［4－5］测定PB-2对葡萄霜霉病菌的室内抑制活性。试验设6个处理:PB-2改良的NA发酵液(30℃，120 r/min培养36 h，菌体含量2.3×109cfu/mL)无菌水稀释成菌体含量106、107、108cfu/mL，过0.22 μm滤膜的PB-2发酵液，72%甲霜灵锰锌可湿性粉剂(江苏宝灵化工股份有限公司)600倍稀释液，无菌水对照。从山东省科学院东区葡萄试验田采集发病叶片和新梢第4～6轮未发病叶片(感病品种“玫瑰香”)。用无菌水洗下发病叶片的病菌孢子囊，配成霜霉病孢子悬浮液(孢子囊浓度控制为106cfu/mL)，4℃下存放备用。准备培养皿若干，内置不同处理溶液润湿的滤纸，用打孔器在未发病叶片的叶脉间打孔制成直径1 cm的叶盘，分别置于这些含有不同药液处理的5 cm培养皿中，每处理重复3次，每皿加3片叶盘，叶背面朝上分别摆放于药液润湿的吸水纸上，将配制好的孢子囊悬浮液10 μL接种于叶盘中央。置于人工气候室中，22℃下培养，7 d后观察结果。根据病斑面积占叶盘面积的百分比划分病级，0级:无病斑;1级:1% ～20%;2级:21% ～50%;3级:＞50%。计算病情指数和抑制率。

1.2.2 PB-2 的田间药效试验

首先制备PB-2可湿性粉剂，先将PB-2改良的NA发酵液(菌体含量2.3×109cfu/mL)与填料麦饭石(200目)按比例吸附混合至活菌体数109cfu/g，添入黄原胶(0.5%)、十二烷基磺酸钠(0.25%)和羧甲基纤维素(5%)混合均匀，自然晾干制得拮抗性多粘类芽胞杆菌PB-2可湿性粉剂。LTR-2(木霉)可湿性粉剂(中试产品，含2×108cfu/g木霉活孢子)

试验地点选在山东省科学院东区葡萄试验田内进行，品种为“玫瑰香”(感病品种)，常规栽培措施管理。试验按农业部药检所田间试验准则设计［6－7］。共7个处理:PB-2可湿性粉剂用清水稀释50、100、200倍，LTR-2(木霉)可湿性粉剂用清水稀释50、100、200倍，清水对照。采用喷雾法施药，在16:00后进行，避开高温时间。每处理3株，重复3次，随机区组设计。重点喷施叶背，均匀喷施，以少量滴水为度。分别于施药后1周、2周2次随机选取每处理上、中、下部位100片叶调查病叶率、病情指数和相对防治效果。病情分级标准和病情指数计算方法按照国家公益性行业(农业)科研专项“果树霜霉病防控技术研究与示范”进行，葡萄霜霉病在叶片上的分级标准:0级:无病斑;1级:病斑面积占整个叶面积的5%以下;3级:病斑面积占整个叶面积的6% ～25%;5级:病斑面积占整个叶面积的26% ～50%;7级:病斑面积占整个叶面积的51% ～75%;9级:病斑面积占整个叶面积的75%以上。病情指数=［∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×9)］×100。

2 结果与分析

2.1 PB-2发酵液对葡萄霜霉病菌的室内抑制活性

从表1中可看出，菌含量为108cfu/mL的PB-2发酵稀释液对葡萄霜霉病菌抑制率达到了77.22%，与对照药剂72%(质量分数)甲霜灵锰锌可湿性粉剂600倍稀释液的抑制率(81.61%)相当，显著优于其他处理;PB-2无菌滤液的抑制率(60.23%)与PB-2发酵液菌体含量107cfu/mL的抑制率(63.34%)无显著差异;菌含量为106cfu/mL的PB-2发酵稀释液的抑制率(53.16%)最低，显著低于其他处理。

表1 PB-2发酵液对葡萄霜霉病菌的室内抑制活性Table 1 Indoor inhibition activity of PB-2 fermentation broth against Plasmopara uiticola

2.2 PB-2可湿性粉剂对葡萄霜霉病的田间药效

由表2可知，PB-2可湿性粉剂的50、100倍稀释液对葡萄霜霉病具有较好的防治效果，施药后1周相对防效分别为46.91%和36.99%，2周后分别为46.44%和42.10%。LTR-2可湿性粉剂50倍稀释液在1周后防效为33.81%，对葡萄霜霉病也有一定的防效，但持续性差，2周后防效不明显，试验未发现PB-2可湿性粉剂稀释液对植株和果实有不良影响。

表2 PB-2可湿性粉剂对葡萄霜霉病的田间药效Table 2 Field control efficacy of PB-2 wettable powder against grape downy mildew

3 讨论

多粘类芽胞杆菌作为生防菌已有大量的研究报道，已发现其对终极腐霉菌(Pythium ultimum)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)以及番茄叶霉病菌(Cladosporium fulvum)等多种病原真菌具有明显的抑制作用。但用于葡萄霜霉病的研究还较少，田间实际应用并有较好稳定防效的则更是鲜有报道［8］。本试验室筛选到的拮抗菌PB-2无论在室内还是在田间，对葡萄霜霉病均具有较好的防效，有希望开发成为一种可有效防治葡萄霜霉病的生防制剂。目前我们已初步开发成了制剂，进一步的田间防效试验也正在进行当中，结果将在后续的文章中予以报道。

葡萄霜霉病是田间比较难防治的一种病害，PB-2可以较好防治葡萄霜霉病主要原因可能是:PB-2产生多肽类抗菌物质且性质比较稳定，胞外分泌多种胞壁降解酶，如具有较高的β-1，3-葡聚糖酶等纤维素酶类活性［9］，而葡萄霜霉病菌作为一种低等真菌其细胞壁以纤维素为主，PB-2胞外分泌的纤维素降解酶类可以破坏其细胞壁，从而抑制其生长。实验室生测和田间试验结果表明，多粘类芽孢杆菌PB-2具有潜在的开发应用前景。

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