高速逆流色谱(盐溶液体系)分离制备白芍中的芍药苷

刘浩，杭伟，周晓晶，陈义伦，王晓，段文娟*

(1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018;2.山东省科学院中药过程控制研究中心，山东省分析测试中心，山东 济南 250014;3.北京理化分析测试中心，北京 100089)

白芍为毛茛科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效。用于血虚萎黄、月经不调、自汗、盗汗、胁痛、腹痛、四肢挛痛和头痛眩晕等症状［1］。芍药苷是白芍中的主要活性成分，具有抗炎、止痛、抗风湿、保护肝脏等功效，且具有一定的抗癌作用［2－3］。临床上芍药苷制剂被广泛地应用于治疗心脑血管、肢节痛疼等疾病。

目前报道的芍药苷的制备主要采用大孔树脂、硅胶柱色谱和高效液相色谱等方法［4－6］，但这些方法存在耗时长、溶剂消耗大、容易造成样品的不可逆吸附、变性及样品回收率低等缺点，利用传统分离方法，不能对其进行快速有效的分离。因此，建立一种快速分离制备芍药苷的方法非常必要。

高速逆流色谱技术是一种建立在特殊的流体动力学平衡基础上的液－液分配色谱技术，不会出现固态支撑材料对样品和分离结果的不可逆吸附、干扰、污染、失活及变性等不良影响。而且，因为分离柱内没有固态填料占体积，容易实现较大的进样量和制备量;不含价格不菲的填料，所以制备的成本低［7－8］。常用于高速逆流色谱的溶剂体系为氯仿－甲醇－水、石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水以及正丁醇－水等，这些溶剂体系适用于分离纯化中等极性的化合物，对于一些高极性的糖苷类成分，很难达到理想的分离效果。本文将盐水体系应用于高速逆流色谱技术，对白芍中的芍药苷进行分离、纯化，建立了一种快捷、简单的芍药苷制备方法，为高极性化合物的分离纯化提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器

GS10A型高速逆流色谱仪(北京艾美林科技有限公司)、TBP泵(上海同田生物技术有限公司)、多层聚四氟乙烯螺旋管(直径2.3 mm，分离体积300mL，β值为0.5～0.8)、8823B－紫外检测器(北京宾达英创科技有限公司)、3057－11记录仪(重庆川仪总厂有限公司);Waters 600－996高效液相色谱系统 (Waters－600溶剂输送泵，Water－996二极管阵列检测器，Empower工作站，美国Waters公司)。Varian INOVA－600核磁共振波谱仪 (美国Varian公司);Agilent 1100 Series 6320 ion－trap质谱仪 (美国Agilent公司)。

1.2 试剂与材料

粗提物的制备及HSCCC分离用乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和硫酸钠等试剂均为分析纯;高效液相色谱用甲醇为色谱纯(美国天地公司)，水为过滤蒸馏水。

白芍药材购自山东省中医药大学中鲁医院，经山东省中医药大学李佳教授鉴定为毛茛科植物芍药的根。

1.3 溶液的配置

分别称取30 g和50 g Na2SO4，于室温下溶于1000mL纯水中，超声使Na2SO4完全溶解。KH2PO4同样按上述方法配制浓度为5%的溶液。

1.4 芍药苷粗品的制备

取白芍药材500 g，加入8倍量75%的乙醇加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩得浸膏112.65 g，加2 L水混悬后，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯分别萃取3次，水相减压浓缩得芍药苷粗提物81.47 g，供高速逆流色谱分离用。

1.5 两相溶剂体系及样品溶液的制备

本实验所用的溶剂体系为正丁醇－乙酸乙酯－5%Na2SO4溶液(4:1:5，V/V)，按比例配置2 L于分液漏斗中，剧烈振荡使充分混合，于室温静置分层。分出上下相，使用前超声脱气15 min备用。

取芍药苷粗提物100mg，加入上下相各2 mL，振荡使其完全溶解，用于HSCCC分离。

1.6 分配系数(KD)的测定

分配系数的测定按文献［9－10］中的方法，分别量取已经平衡好的溶剂体系中2 mL上相和2 mL下相置于试管中，加入少量芍药苷粗提物，充分振摇，静置分层，分别取20 μL上、下相的溶液，用HPLC进行检测。以上相组分峰面积(AU)与下相组分峰面积(AL)的比值来计算样品在该溶剂体系中的分配系数KD。

1.7 HSCCC法分离制备过程

将已超声脱气的上相(固定相)以20mL/min流速泵入HSCCC螺旋管中，待上相充满整个螺旋管，打开主机，使高速逆流色谱仪螺旋管柱按照顺时针的方向旋转，当转速达到800 r/min时，以2.0mL/min流速将下相(流动相)泵入高速逆流色谱仪，待流出的上相体恒定后即平衡完毕，进样，紫外检测波长为254 nm，根据记录信号的出峰情况分别收集流出液。收集的溶液通过HPLC检测，合并目标成分。

1.8 HPLC 分析条件

色谱柱:Intersil ODS－SP(4.6 mm ×250mm，5 μm);流动相:A 为甲醇，B 为0.2%冰乙酸溶液。梯度洗脱程序为0～20min，5% ～100%A;流速:1 mL/min;检测波长:254 nm;柱温:室温;进样量:20 μL。

2 结果与讨论

2.1 HSCCC分离条件的优化

逆流色谱作为分配色谱，样品分离的必要条件是选择适合目标成分的溶剂系统，溶剂系统的选择可通过测定分配系数KD来确定。在HSCCC分离过程中，最合适的KD值范围是0.5～2。若KD＜0.5，出峰时间太快，组分峰之间的分离度较差，达不到分离目的。当KD＞2时，出峰时间较长，且峰形变宽，分离效率太低。而当0.5＜KD＜2时，目标成分通常可以在合适的时间出峰，并能得到较好的分离效果［11］。

应用高速逆流色谱分离高极性化合物通常采用的溶剂体系为正丁醇-水体系［12］。但是，当目标化合物的极性过高时，即使采用正丁醇-水体系也很难达到满意的分离效果，这是由于化合物极性高，在两相溶剂的分配中主要在下相，KD值偏小，分离效果差。当在水相中添加适量的无机盐时，由于无机盐改变水溶液的离子强度，使目标化合物在有机相中的溶解度增大，提高KD值，从而达到理想的分离效果。本实验测定了目标化合物在乙酸乙酯－正丁醇－Na2SO4和乙酸乙酯－正丁醇－KH2PO4溶剂体系中的KD值，结果见表1。当采用正丁醇－乙酸乙酯－5%KH2PO4(4:1:5，V/V)为两相体系时，KD值为0.25，小于0.5，目标化合物与杂质一起被洗脱出来，无法达到理想的分离效果。改变盐的种类，将KH2PO4换成Na2SO4。若采用正丁醇－乙酸乙酯－3%Na2SO4(3:2:5，V/V)为两相容积体系时，KD值为0.17，小于0.5，也无法达到理想的分离效果。通过降低桥溶剂的比例，将体系改为正丁醇－乙酸乙酯－3%Na2SO4(4:1:5，V/V)，KD值增加到0.47，但是，分离效果还是较差，无法得到高纯度的目标化合物。调整Na2SO4的浓度，增大下相中的离子强度，增加目标化合物在上相中的分配，KD值为0.61，在0.5～2的范围内，适合HSCCC分离。故采用正丁醇－乙酸乙酯－5%Na2SO4为HSCCC分离芍药苷的溶剂体系。本实验还对流动相的流速进行了优化，当流动相的流速较大时，分离效果差;流速较小时，分离时间过长。最后确定流速为2 mL/min，既节约时间和溶剂，又能达到良好的分离效果。

表1 样品在不同溶剂体系中的KD值Table 1 KDin different solvent systems

2.2 HSCCC 分离

以正丁醇－乙酸乙酯－5%Na2SO4(4:1:5，V/V)为两相溶剂体系，按照1.5节所述的方法对芍药苷粗提物进行分离纯化。称取100mg粗提物于试管中，分别加入2 mL的上、下相，充分振摇后进行HSCCC分离，从100mg待分离样品中一次性得到56.13 mg化合物I。HSCCC图见图1。

图1 芍药苷粗提物的高速逆流色谱图Fig.1 HSCCC chromatogram of the crude extract of paeoniflorin

2.3 HPLC分析条件优化及结果

分别考察了甲醇－水、乙腈－水和甲醇－0.2%乙酸溶液作为流动相时的分离情况，结果表明，当流动相为甲醇－0.2%乙酸溶液时分离效果良好，因此本实验采用甲醇－0.2%乙酸溶液为流动相。

取适量的芍药苷粗提物、HSCCC分离后的馏分I，用甲醇(色谱纯)溶解并过0.45 μm滤膜后，经HPLC分析，图2为相应的HPLC图。图2A是芍药苷粗提物甲醇溶液的HPLC图，图2B是HSCCC分离后馏分I的HPLC图。可见样品在粗提取后依旧有很多杂质，经HSCCC分离后，得到了高纯度的化合物I。采用面积归一法，测得化合物I的纯度在98%以上。

图2 HPLC分析色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of the samples

2.4 化合物结构鉴定

化合 物 I:ESI－MS(positive)，m/z:503［M+Na］+。1H NMR(600MHz，DMSO－d6)δ:8.04(2H，d，J=7.2 Hz，H－2″，6″)，7.68(1H，t，J=7.2 Hz，H－4″)，7.55(2H，d，J=7.2 Hz，H－3″，5″)，5.35(1H，s，H－9)，4.96(1H，d，J=4.8 Hz，H－1′)，4.41(2H，s，H－8)，3.68(1H，d，J=8 Hz，H－6′)，3.0－3.6(m，HGlc)，2.46(1H，d，J=6 Hz，H－5)，2.38(1H，dd，J=10.6 Hz，H－7β)，2.09(1H，d，J=12 Hz，H－3β)，1.83(1H，d，J=10.6 Hz，H－7α)，1.68(1H，d，J=12 Hz，H－3α)，1.31(3H，s，H－10);13C－NMR(150MHz，DMSO－d6):δ 88.1(C－1)，85.5(C－2)，44.1(C－3)，105.2(C－4)，42.7(C－5)，70.7(C－6)，22.4(C－7)，61.7(C－8)，100.6(C－9)，19.6(C－10)，99.1(C－1′)，73.4(C－2′)，77.3(C－3′)70.4(C－4′)，77.3(C－5′)，61.7(C－6′)，130.1(C－1′′)，129.8(C－2′′)，129.2(C－3′′)，133.9(C－4′′)，129.1(C－5′′)，129.7(C－6′′)，166.2(C－7′′)。以上波谱数据与文献［13］基本一致，因此鉴定其为芍药苷。

本研究采用正丁醇－乙酸乙酯－5%Na2SO4体系分离纯化芍药中的芍药苷，具有简便、快捷、节省溶剂以及重现性好等特点。而且与Chen等［14］所做的研究相比，本文通过使用添加无机盐的高速逆流色谱体系，使芍药苷HSCCC色谱峰与杂质HSCCC色谱峰达到了基线分离，因此极大地提高了芍药苷与粗提物中其他化学成分在HSCCC分离过程中的分离度。该研究为芍药中芍药苷的分离制备提供了一种新型、实用的方法，并且为高极性化合物的HSCCC分离纯化提供了新的思路。

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