SNARE蛋白调控细胞自噬的分子机制

陈元渊, 陈红岩, 卢大儒

复旦大学生命科学院, 遗传学国家重点实验室, 上海 200433

SNARE蛋白调控细胞自噬的分子机制

陈元渊, 陈红岩, 卢大儒

复旦大学生命科学院, 遗传学国家重点实验室, 上海 200433

细胞自噬是细胞在面对内外部环境压力的情况下, 为了自身的稳定而采取的一种降解内部及外来入侵物质的机制。SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors)假说指出SNARE蛋白在细胞物质运输以及特异性膜融合过程中具有重要作用, 揭示了细胞正常生理活动有序进行的分子机制。由于细胞自噬涉及从自噬体的形成到自噬体溶酶体的融合等诸多膜融合的过程, 因此, 文章对近年来 SNARE蛋白在调控细胞自噬过程的研究进展进行了综述。

细胞自噬; SNARE假说

细胞自噬(Autophagy)是细胞在面对内外环境压力时采取的一种维持自身稳定的机制, SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors)假说是关于细胞在物质运输过程中特异性膜融合的理论, 该假说认为在细胞内的运输小泡及靶膜上都存在着 SNARE蛋白, 它们互相识别结合, 为物质的运输提供了特异性, 保障了细胞正常生理活动的有序进行。由于细胞自噬的发生也需要物质的运输以及膜与膜融合等过程的协同作用,因此, SNARE蛋白在其中也发挥了不可或缺的重要作用[1]。本文就近年来SNARE蛋白在调控细胞自噬方面的研究进展进行了综述。

1 细胞自噬

细胞自噬是真核生物细胞内部降解大分子蛋白、细胞器以及外来病原微生物的重要途径。根据降解底物的类型、底物运输的方式和调控机制的不同, 细胞自噬分为巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)以 及 分 子 伴 侣 介 导 的 自 噬(Chaperone-mediated autophagy)。其中, 巨自噬是目前研究最为广泛的细胞自噬类型, 通过该途径降解的底物种类也是最多的, 因此在通常情况下, 细胞自噬指的就是巨自噬(下同)类型。

细胞自噬是一个多步骤、受多种蛋白调控的复杂过程。当细胞自噬的程序被启动时, 细胞会在其内部合成一种被称为自噬体(Autophagosome)的双层膜结构, 自噬体会将细胞内部待消化的物质完全包裹吞噬后送入溶酶体 (动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。通过这一过程, 细胞自噬不仅可以为细胞在饥饿的环境中提供必需的营养物质, 还可以及时清除扰乱细胞内稳态的危险因素,使细胞能够更好地适应外部环境的变化, 抵御外来物质的入侵, 从而维持正常的生理功能[2～4]。研究表明,细胞自噬功能的紊乱可以导致多种疾病的发生[5～8]。

细胞自噬的进程包括从自噬体胞膜的形成、延伸与成熟到自噬体与溶酶体融合等步骤, 这些阶段涉及许多膜与膜融合的过程, 因此研究者推测对细胞膜融合过程的调控也可以影响细胞自噬的发生发展, 从而改变细胞对外界环境的适应能力。

2 SNARE假说

SNARE假说是2013年诺贝尔生理医学奖得主James Rothman与同事根据他们对动物细胞融合的研究而提出的理论。动物细胞融合需要一种可溶性的细胞质蛋白——N-乙基马来酰亚胺敏感的融合蛋白(N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein, NSF)以及其他几种可溶性的 NSF附着蛋白(Soluble NSF attachment protein, SNAP)。由于 NSF/SNAP 能够介导不同类型小泡的融合, 说明它没有特异性。据此Rothman 等提出一种假设：膜融合的特异性是由另外的膜蛋白提供的, 把这种蛋白称为 SNAP受体蛋白(SNAP receptor), 或称为SNARE, 这种蛋白可以作为膜融合时 SNAP的附着点。按照Rothman的SNARE假说, 每一种运输小泡都有一个特殊的 V-SNARE (Vesicle-SNAP receptor)标志, 能够同适当靶膜上的T-SNARE (Target-SNAP receptor) 标志相互作用。然而在某些情况下, 细胞内也会发生同种类型的膜融合作用, 为了避免混淆, 根据SNARE蛋白残基端一段高度保守的区域, 又可分为 R-SNARE(Argininecontaining SNARE)与Q-SNARE(Glutamine-containing SNARE)。一种运输小泡在没有找到合适的靶位点之前可能会与几种不同的膜位点进行暂时性地接触,然而这种接触是不稳定的, 只有找到真正的靶位点后才会形成稳定的结构。换言之, 在不同的小泡上存在不同的 V-SNARE, 它们能识别靶膜上特异的T-SNARE 并与之结合, 以此保证运输小泡到达正确的目的地[2,3,9]。目前已发现了数十种SNARE蛋白参与胞内各个细胞器以及细胞间的物质信号传递过程。

3 SNARE蛋白对细胞自噬的调控

3.1 自噬前体形成的调控

自噬体的形成是细胞自噬过程的第一步, 尽管已发现有多达18种Atg蛋白参与了自噬体的形成[10],但是关于自噬体的起源目前仍无定论[11]。已有的研究指出[12], 哺乳动物中 Atg蛋白家族成员以有序的方式先后聚集到细胞内质网附近的区域并形成自噬前体结构(Pre-autophagosomal structure, PAS)。而作为核心Atg蛋白家族成员中的跨膜蛋白, Atg9调控其他Atg蛋白的招募过程并且在PAS附近形成Atg9小泡帮助PAS的形成[13,14]。同时, Atg9小泡通过与PAS的膜融合可以为自噬体外膜的形成提供必需的脂类物质[15]。SNARE假说作为重要的膜融合机制在此过程中发挥了重要的调控作用。Nair等[16]在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现, Q/t-SNARE蛋白Sso1/2和Sec9可以有效地促进Atg9小泡与PAS的膜融合过程以及Atg8蛋白的招募。在Sso1/2和Sec9的突变体中, Atg9与PAS的荧光信号共定位比率分别下降43%和36%, 而Atg8与PAS的荧光信号甚至无法共定位。此外, Ykt6蛋白与 Q/t-SNARE型的Tlg2蛋白和R/v-SNARE型的Sec22蛋白共同组成复合物, 调控Atg9小泡的转运与自噬体的形成。由此可见, SNARE蛋白调控了Atg9小泡与PAS的膜融合, 相关SNARE蛋白的突变可以影响PAS的形成从而导致细胞自噬过程的阻滞。

3.2 吞噬泡成熟的调控

在细胞自噬体形成的早期, 由 Atg12、Atg5以及Atg16L1组成的蛋白复合物Atg16L1-Atg12-Atg5结合在早期自噬体的外表面, 帮助其成熟, 直到自噬体完全形成后释放至胞浆中。因此, 结合有Atg16L1-Atg12-Atg5复合物的自噬体由于还没有完全成熟, 故被称为吞噬泡[17]。研究发现[18], SNARE蛋白VAMP7以及它的互作蛋白Syntaxin7、Syntaxin8和Vti1b与吞噬泡上的Atg16L1和Atg5共定位, 参与调控自噬体的形成。上述蛋白的缺失可以显著抑制自噬体的形成与 Atg16L1小泡的融合并限制Atg16L1小泡的扩张。研究还进一步证实, VAMP7蛋白的Hrb与Longin结构域作为其关键的功能区域,可以促进其与网格蛋白的接头蛋白 AP-2相互作用,从而参与网格蛋白介导的细胞内吞过程, 帮助VAMP7蛋白从细胞膜表面运输至胞浆内参与调控细胞自噬。上述两个结构域的缺失可以阻断VAMP7蛋白的功能从而抑制细胞自噬体的形成并减小Atg16L1小泡的体积。由此可见, SNARE蛋白VAMP7及其互作蛋白可以通过Atg16L1来调控吞噬泡的成熟, 进而改变细胞内的自噬水平。

3.3 早期自噬体形成的调控

目前, 除了与自噬体形成相关的信号蛋白的具体调控机制受到人们的关注之外, 对于自噬体早期形成时的亚细胞定位也逐渐成为研究热点。已有许多证据显示, 在哺乳动物细胞中, 自噬体早期的形成定位在细胞内质网与线粒体交会的区域：在细胞自噬发生初期, 自噬相关蛋白ULK1与Atg14L在内质网附近都有表达[12,19], 对细胞自噬进行诱导之后可以促使 Atg14L信号聚集在内质网线粒体交会区域[20,21]; 此外, 另一个自噬体标签蛋白Atg5也和线粒体相关的内质网膜(Mitochondria-associated ER membrane, MAM)标签蛋白VDAC1在胞浆内的定位相互接近[21]。然而, Atg14L蛋白通过什么机制聚集到自噬前体上参与自噬体的形成呢？研究发现[21]在通过饥饿的方法诱导细胞自噬后, SNARE蛋白Stx17与Atg14L相似, 也大量聚集在内质网线粒体的交会区域, 并且Stx17与Atg14L有很强的相互作用。当Stx17表达被抑制以后, Atg14L无法在内质网线粒体交会区域聚集, 同时Atg5蛋白也始终定位在自噬体膜上(自噬体完全形成之后, Atg5蛋白会从自噬体膜上解离下来)。上述证据暗示, SNARE蛋白Stx17是自噬体形成的必需因子, 参与自噬相关蛋白Atg14L定位至自噬体形成区域的过程, 调控早期自噬体的形成。

3.4 自噬溶酶体形成的调控

SNARE蛋白Stx17在细胞自噬体早期形成方面具有重要的调控, 最近发现其在自噬溶酶体形成过程中也具有重要作用。Itakura等[22]研究发现, 在通过饥饿的方法诱导细胞自噬后, Stx17蛋白能够转运至自噬体上, 并且通过与溶酶体上的 SNARE蛋白VAMP8以及另外一个SNARE蛋白Snap-29相互作用, 促进自噬体与溶酶体的融合, 完成细胞自噬的过程。抑制Stx17的表达后, 细胞内自噬体不断积聚但自噬溶酶体的数量却没有因此增加, 这意味着自噬体与溶酶体的融合被阻断。研究进一步指出, Stx17蛋白的C端有一个独特的结构域, 使其形成一个发夹状的结构。当自噬体与溶酶体进行融合时,这个定位于自噬体外膜上的“发夹”结构域可以与VAMP8和Snap-29蛋白互作, 促进自噬体与溶酶体的融合, 从而调控细胞自噬的过程。

近年来的研究证据显示, 可能有不止一对的SNARE蛋白参与细胞自噬体与溶酶体的融合。Furuta等发现[23,24], 位于自噬体上的 SNARE蛋白Vti1b也可以与溶酶体上的SNARE蛋白VAMP8结合, 调控自噬体与溶酶体的融合过程。同时抑制Vti1b与 VAMP8的表达可以阻断自噬体标签蛋白LC3与溶酶体标签蛋白LAMP1荧光信号的共定位。上述两个研究暗示在自噬溶酶体的形成过程中, 可能同时需要多对 SNARE互作蛋白为自噬体膜与溶酶体膜的融合提供特异性, 但是 SNARE蛋白VAMP8与Stx17及Vti1b三者究竟是一种什么样的互作关系呢？Itakura等[22]发现, Stx17蛋白既与VAMP8蛋白结合, 又与Vti1b蛋白结合。分别抑制VAMP8或Vti1b的表达后, 发现在VAMP8抑制组的细胞内, 自噬体标签蛋白LC3的荧光信号显著高于对照组, 表明细胞内部的自噬体无法与溶酶体结合, 从而导致其数量不断增加并最终发生自噬流(Autophagic flux)的阻断; 而Vti1b抑制组的细胞则没有出现上述现象。由此证实, 在自噬溶酶体的形成过程, Stx17与VAMP8这一对SNARE蛋白的作用对细胞自噬溶酶体的形成是必不可少的, Vti1b与VAMP8的作用可能是一种促进作用。

综上所述, 作为细胞重要的物质信号传输转运系统, SNARE蛋白在细胞自噬体的早期发生、形成与成熟以及最后与溶酶体的融合过程中均起着不可替代的调控作用, 相关蛋白的缺失可以导致不可逆转的自噬功能缺陷, 对细胞的正常生理功能产生重大的影响。

4 展 望

细胞自噬作为细胞面对环境压力下重要的生存机制目前已经得到了广泛的研究, 同时也有越来越多的报道指出, 细胞自噬在某些情况下还是促使细胞程序性死亡的重要手段。这些证据暗示, SNARE蛋白作为一种调控细胞自噬的重要机制, 在细胞生死决策中的作用可能也不可或缺。目前, 包括肿瘤研究在内的疾病研究中, 细胞自噬本身受到了人们的广泛关注与研究, 然而对于调控细胞自噬的SNARE蛋白在疾病的发生发展、药物耐受等过程中的作用却报道较少。除了细胞自噬, SNARE蛋白在葡萄糖的转运、血管生成以及细胞转移等方面的调控作用已有研究报道。SNARE蛋白的生物学功能是重要并且多样的, 机制还有待进一步阐明, 为了能够进一步揭示 SNARE蛋白在疾病尤其是肿瘤的发生发展、放化疗耐受以及临床预后中的作用与机制,全面地了解 SNARE蛋白在细胞中的具体作用, 未来还需要从不同的角度, 从基础和临床研究两方面更多地开展针对性研究, 积累更加全面和丰富的证据和数据, 并积极探索针对 SNARE蛋白药物靶点设计开发新药的研究。

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(责任编委: 周荣家)

Molecular mechanisms of SNARE proteins in regulating autophagy

Yuanyuan Chen, Hongyan Chen, Daru Lu

State Key Laboratory of Genetics, School of Life Science, Fudan University, Shanghai 200433, China

Autophagy is a self-protective mechanism that degrades inner and outer invaded substances to sustain self-maintenance. SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors) hypothesis suggests important roles of SNARE proteins in the cellular activities of substance transport and specific membrane fusion, unveiling the molecular mechanisms of normal and physiological activities within a cell. Since autophagy involves membrane fusions from the birth of autophagosomes to the formation of autolysosomes, we review recent research progress on the roles of SNARE proteins in regulating autophagy.

autophagy; SNARE hypothesis

2013-12-09;

2014-01-14

国家自然科学基金项目(编号：81372706, 81372235 资助)

陈元渊, 博士研究生, 研究方向：分子遗传学。E-mail: xoocharles@163.com

卢大儒, 博士, 教授, 研究方向：遗传学。E-mail: drlu@fudan.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0547

时间: 2014-5-4 15:26:59

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140504.1527.006.html