蓝莓花青素通过下调p53基因DNA甲基化抑制口腔癌KB细胞增殖及诱导细胞凋亡

陈琦, 李少伟, 贾宇臣, 王利

内蒙古医科大学分子生物学研究中心, 呼和浩特 010059

蓝莓花青素通过下调p53基因DNA甲基化抑制口腔癌KB细胞增殖及诱导细胞凋亡

陈琦, 李少伟, 贾宇臣, 王利

内蒙古医科大学分子生物学研究中心, 呼和浩特 010059

文章从内蒙古野生蓝莓(Vaccinium uliginosum Lim)中提取花青素, 观察其对口腔癌细胞株KB的增殖及凋亡的作用, 探讨其作用机制与p53基因甲基化的相关性。利用含0.1%盐酸的甲醇提取花青素, 用高效液相色谱-质谱(High performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS )鉴定花青素的成分。利用四甲基偶氮唑蓝(Methylthiazolyl-tetrazolium, MTT)比色法、流式细胞术、免疫荧光法、免疫细胞化学法和Western blot法分析蓝莓花青素对 KB细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和 p53蛋白表达的影响; 利用甲基化特异性 PCR法(Methylation-specific PCR, MSP)分析蓝莓花青素诱导细胞凋亡与p53基因甲基化的关系。结果显示, 内蒙古自治区的野生蓝莓中至少存在14种花青素成分; 蓝莓花青素呈剂量依赖的方式抑制KB细胞增殖, 诱导细胞周期阻滞在 G2/M 期, 而且能诱导细胞凋亡; 蓝莓花青素处理后 Caspase-9蛋白和细胞色素 C的表达明显增加; Western blot结果表明蓝莓花青素可以诱导KB细胞中p53蛋白表达上调; MSP结果表明随蓝莓花青素浓度增加,未甲基化的p53的比例增加, 说明p53的甲基化状态有所下调。

花青素; 抗癌; 蓝莓; 口腔癌; DNA甲基化

口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤, 手术是目前治疗口腔癌的主要手段, 但由于其发病部位解剖学上的复杂性, 一般通过手术很难完全地去除肿瘤,术后容易发生转移。因此, 发展一种有效的抗癌剂是临床上防治口腔癌面临的重大课题[1]。从天然动植物中寻找可以防治肿瘤的有效成分是目前和今后癌症研究领域的前沿和热点。

花青素是一类天然色素, 不但赋予水果、蔬菜以颜色, 对人类健康也有重要的意义[2]。研究表明,花青素具有许多生物活性[3], 如控制肥胖[4]和糖尿病[5]、预防心血管疾病[6]、改善视力[5]和大脑功能[7]等, 特别是在抗肿瘤治疗方面具有巨大的潜力[8]。花青素广泛存在于多种水果和蔬菜中, 其中属蓝莓(Vaccinium uliginosum Lim)中的花青素含量最高9]。

研究发现, 花青素可以抑制多种肿瘤细胞生长,包括胃癌[10]、乳腺癌[11]、肺癌[12]、结肠癌[13]等, 但国内对内蒙古自治区野生蓝莓的研究主要集中在蓝莓加工、提取花青素及检测方法方面, 对其生物活性的研究还很少, 蓝莓花青素发挥抗口腔癌作用的分子机制也尚未明确。因此, 为了研究蓝莓花青素对人口腔癌 KB细胞的生长抑制作用及细胞凋亡的诱导效应, 本研究从内蒙古自治区野生蓝莓中提取花青素, 用高效液相色谱-质谱联用(High performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLCMS)技术鉴定其成分, 利用不同浓度的蓝莓花青素处理口腔癌 KB细胞, 用四甲基偶氮唑蓝(Methylthiazolyl-tetrazolium, MTT)比色法、流式细胞术、免疫细胞化学法和甲基化特异性 PCR(Methylationspecific PCR)法分析蓝莓花青素对KB细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响, 并从表观遗传学角度探索其诱导细胞凋亡的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人口腔癌 KB细胞为内蒙古医科大学分子生物学研究中心保存; 内蒙古自治区呼伦贝尔根河市野生蓝莓, 品系为杜鹃花科越橘属矮丛蓝莓, 液氮速冻-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 蓝莓花青素的提取及鉴定

蓝莓花青素的提取纯化方法参照文献[14], 并略作修改。具体方法如下：蓝莓从液氮中取出, 称重后研磨, 利用含有 0.1% HCl 的甲醇作为提取溶剂, 按照蓝莓与提取溶剂 1:4 的比例, 将研磨后的蓝莓溶于提取溶剂中2 h。将混合物4000 r/min离心15 min, 0.25 μm滤器进行过滤, 然后通过40℃旋转蒸发去除残留的甲醇和盐酸。利用大孔树脂 AB-8对粗提物进行纯化, 纯化后的花青素利用HPLC-MS鉴定, 通过与质谱库中的数据进行比较, 分析蓝莓花青素的成分。

1.2.2 细胞增殖分析

取对数生长期的 KB细胞经过胰酶消化, 以2.5×105/mL的密度接种于96孔板, 培养24 h后, 弃原培养液, 加入终浓度分别为 50、100、150、200 μg/mL的200 μL蓝莓花青素混匀, 每个浓度设6个复孔, 正常组不加蓝莓花青素。24 h后每孔加 5 mg/mL MTT溶液20 μL, 4 h后弃去培养液, 每孔加DMSO 150 μL, 置于脱色摇床上振荡10 min, 利用酶标仪在吸光度570 nm检测, 实验重复3次。根据下面公式计算细胞抑制率：

1.2.3 细胞周期分析

用浓度分别为0、50、100、150、200 μg/mL的蓝莓花青素处理KB细胞24 h后, 用胰酶消化细胞, 70%乙醇进行固定。然后加入含有 5 μg/mL碘化丙啶(PI)和1 mg/mL RNase的PBS重悬细胞。利用流式细胞仪(Becton)进行细胞周期分析。

1.2.4 细胞凋亡分析

(1)流式细胞术PI染色法检测细胞凋亡：操作同1.2.3。

(2)Annexin V/PI荧光染色法检测细胞凋亡：调整KB细胞密度为1×105/mL接种于6孔板, 24 h后分别加入50、100、150、200 μg/mL含花青素的培养基, 设正常对照组。24 h后去除培养液, PBS洗涤2次, 各组加入195 μL结合液(binding buffer), 然后加入5 μL Annexin V染液, 吸去液体后加入190 μL结合液, 然后加入5 μL PI染液, 在倒置荧光显徽镜下观察细胞凋亡情况, Annexin V 对磷脂酰丝氨酸高度的亲和性可以检测细胞的早期凋亡, PI仅能透过胞膜受损的细胞, 嵌入核DNA, 发橘红色荧光。

1.2.5 免疫细胞化学法检 测 Caspase-9 和Cytochrome-C的表达

用灭菌的盖玻片吸附于6孔板中, 调整KB细胞密度为1×105/mL, 接种于6孔板, 24 h后分别加入50、100、150、200 μg/mL含花青素的培养基, 设正常和阴性对照组。24 h后吸去培养液, 取出盖玻片, PBS清洗3次, 每次1 min。丙酮固定 20 min, 干燥5 min。过氧化酶阻断剂37℃ 30 min, PBS清洗后37℃与一抗(1∶500)和二抗(1∶500)各孵育 60 min和30 min。DAB避光显色5 min, 苏木精复染1 min,盐酸分化液分化 2 s, 经梯度脱水, 树胶封片, 风干后用图像采集系统观察 Caspase-9和 Cytochrome-C的表达情况。

1.2.6 Western blot检测p53蛋白的表达

从KB细胞中提取总蛋白, Bradford法对蛋白进行定量, 调节上样量均为20 μg。用10% 的SDS-聚丙烯酰胺凝胶120 V恒压电泳2 h后, 将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。丽春红染色后, 5%脱脂奶粉封闭2 h。一抗孵育 p53以 1∶500稀释, β-actin以 1∶2000稀释。

1.2.7 甲基化特异性PCR

(1)引物设计合成

根据 p53基因序列信息, 利用 Methyl Primer Express Software v1.0.设计两对引物, 一对为甲基化引物(M), 另一对为非甲基化引物(U), 引物信息见表1。

(2) DNA亚硫酸氢盐修饰

利用DNA提取试剂盒(Qiagen公司)从蓝莓花青素处理的KB细胞中提取DNA。配置3 mol/L NaOH、饱和亚硫酸氢钠(40.5%)和10 mmol/L 氢醌。取适量待测样品DNA(100 ng～1 μg), 用3 mol/L NaOH和ddH2O调整至终体积20 μL, NaOH终浓度0.3 mol/L。42℃孵育20 min, 95℃ 5 min, 置于冰上; 加入208 μL 饱和 NaHSO3和 12 μL 10 mmol/L 氢醌, 用NaOH调节pH至5.0; 55℃孵育12～16 h; 通过脱盐柱进行脱盐纯化, 最终洗脱体积50 μL; 加入5.5 μL 3 mol/L NaOH, 37℃孵育15 min; 乙醇沉淀修饰后DNA; 4000 r/min离心15 min, 用70%乙醇洗涤一次;加入30 μL水重悬DNA, 得到修饰后DNA。

(3) PCR扩增

以修饰后的DNA为模板, 用表1中所示的甲基化引物和非甲基化引物分别对甲基化和非甲基化的p53基因进行扩增。PCR扩增体系：修饰后DNA模板 1 μL, MSP引物(5 mmol/L)各 0.6 μL, 2.5×PCR Buffer 4 μL, Taq酶0.1 μL, ddH2O补至10 μL。扩增条件：95℃ 5min; 95℃ 30s, 63℃ 30s, 72℃ 20s,共35个循环; 最后再72℃延伸10min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳, 按每个样本甲基化引物和非甲基化引物的顺序检测。

表1 p53基因的甲基化特异性PCR引物

2 结果与分析

2.1 HPLC-MS鉴定蓝莓花青素

利用HPLC-MS 对提取的蓝莓花青素进行鉴定,结果表明, 内蒙古自治区野生蓝莓中至少含有14种花青素, 包括矢车菊素-单糖、矢车菊素、锦葵色素-单糖、飞燕草素、矮牵牛素、芍药色素、锦葵色素、芍药色素-单糖、飞燕草素-单糖、矮牵牛素-单糖、天竺葵素-3-槐糖 (推测)、天竺葵素-3-葡萄糖 (推测)、天竺葵素-3-葡萄糖 (推测)、天竺葵素-鼠李糖(推测)。

2.2 蓝莓花青素对KB细胞增殖的作用

MTT结果表明, 50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL和200 μg/mL的蓝莓花青素对KB细胞的增殖均有抑制作用, 且基本呈剂量依赖性(图1)。

图1 不同浓度蓝莓花青素对KB细胞增殖率的影响

2.3 蓝莓花青素对KB细胞周期的作用

通过流式细胞仪检测细胞周期中G1、G2/M和S期的分布。结果表明蓝莓花青素处理KB细胞后, G1期细胞明显减少, G2/M期细胞增多, S期细胞相对稳定。说明蓝莓花青素可以使 KB细胞周期阻滞在G2/M期(图2)。

图2 不同浓度蓝莓花青素对KB细胞周期的影响

2.4 细胞凋亡结果

2.4.1 流式PI法检测结果

图3 流式PI法检测蓝莓花青素诱导KB细胞的凋亡M1下的亚二倍体峰即为凋亡峰。

用流式细胞仪PI法检测不同浓度的蓝莓花青素处理KB细胞24 h的凋亡百分率。由图3可以看出,随着蓝莓花青素浓度增大, 凋亡峰增高。凋亡百分率分别为9.73%、25.59%、25.98%、32.56%。

2.4.2 Annexin V/PI荧光染色检测结果

从图4可以看出, PI染色正常活细胞的胞核呈红色, 弥散状; 早期凋亡细胞的胞核浓缩, 染色加深; 晚期凋亡细胞的胞核碎裂成大小不等的原形小体, 即凋亡小体。在正常细胞中, 磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧, 细胞发生凋亡早期,膜磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白, 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力, 它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合凋亡。细胞若发生早期凋亡,经 Annexin V染色后呈现绿色荧光, 正常的细胞基本没有荧光信号, 蓝莓花青素的处理浓度增加, 早期凋亡细胞有所减少, 但荧光强度无明显变化。因此, 蓝莓花青素诱导细胞发生晚期凋亡的比例上升。

2.5 免疫细胞化学结果

KB细胞用不同浓度的花青素处理后呈现不同的生长状态和细胞表达形态, 免疫细胞化学结果用图像采集系统观察, 如图 5所示。蓝莓花青素处理细胞24 h后, 正常组KB细胞中Caspase-9和Cytochrome-C无表达; 随着蓝莓花青素浓度增加, KB细胞形态有明显改变, 细胞出现皱缩、变圆、脱落, 核固缩的情况, Caspase-9和Cytochrome-C在凋亡的细胞中表达逐渐增强。

图4 Annexin V/PI法检测蓝莓花青素诱导KB细胞的凋亡A：PI染色; B：Annexin V染色。1：未加蓝莓花青素的对照组; 2～5：分别为蓝莓花青素浓度50、100、150、200 μg/mL实验组。KB细胞经花青素处理后晚期凋亡比例上升, 早期凋亡不明显。

图5 蓝莓花青素处理对KB细胞Caspase-9和Cytochrome-C免疫细胞组织化学结果A：Caspase-9; B：Cytochrome-C。1：未加蓝莓花青素的对照组; 2～5：分别为蓝莓花青素浓度50、100、150、200 μg/mL实验组。

2.6 Western blot结果

利用Western blot对正常对照组和50、100、150、200 μg/mL蓝莓花青素处理组的KB细胞中的p53蛋白表达进行检测。结果表明(图 6), 正常对照组 p53蛋白没有表达, 经过蓝莓花青素处理后, p53蛋白开始表达, 并且蓝莓花青素浓度在150、200 μg/mL时, p53表达水平比蓝莓花青素浓度50和100 μg/mL时增强。

图6 不同浓度蓝莓花青素处理KB细胞p53蛋白的表达情况1：未加蓝莓花青素的对照组; 2～5：分别为蓝莓花青素浓度50、100、150、200 μg/mL实验组。

2.7 甲基化特异性PCR结果

正常对照组和 50、100、150、200 μg/mL蓝莓花青素处理组的KB细胞p53基因启动子区的MSP结果表明, 正常组甲基化和非甲基化的 p53基因都表达, 实验组随着蓝莓花青素浓度的增加, 非甲基化的 p53表达增加, 当蓝莓花青素的浓度达到 200 μg/mL 时, 只有非甲基化的p53表达(图7)。

3 讨 论

近年来, 从饮食中寻找天然营养素作为癌症的化学预防剂引起了广泛的关注。本研究利用HPLC-MS分析表明, 内蒙古自治区野生蓝莓至少含有14种花青素成分。然而, 花青素结构和功能之间的关系还不是很清楚, 有待于进一步的研究阐明花青素结构与抗癌作用之间的关系。

目前蓝莓花青素诱导口腔癌 KB细胞凋亡的机制尚不明确。p53依赖性细胞凋亡通路主要包括内凋亡通路及外凋亡通路两条主要的信号转导通路,内凋亡通路为p53蛋白调节Bcl-2家族成员, 引起线粒体释放Cyt c, 其与Apaf-1及Pro-Caspase 9可形成凋亡小体, 使 Pro-Caspase 9活化为具有活性的Caspase 9, 并通过一系列级联反应引起效应器Caspase 3的活化; 而外凋亡通路是指活化的p53蛋白通过招募细胞膜表面的死亡受体, 形成死亡诱导信号复合体, 活化 Pro-Caspase 8形成具有活性的Caspase 8, 再活化Caspase 3, 最终导致细胞凋亡的发生[15,16]。目前研究显示, 许多外源性化合物可通过p53依赖性凋亡通路诱导细胞的凋亡[17]。本研究利用免疫细胞化学法探讨蓝莓花青素诱导 KB细胞凋亡的机制, Caspase-9与Cytochrome-C表达明显增多, 呈现一定的剂量依赖性, 说明蓝莓花青素诱导KB凋亡的途径可能通过内凋亡通路诱导口腔癌细胞凋亡。

图7 蓝莓花青素处理KB细胞的p53的MSP结果M和U分别代表甲基化和非甲基化引物扩增的PCR产物。MC和UC分别代表甲基化和非甲基化对照。

表观遗传学是指没有DNA序列改变的、可遗传的遗传修饰。遗传变异是不可逆的, 而表观遗传的改变是可逆的[18]。DNA甲基化是研究的最为透彻的一种表观遗传学修饰, 可引起多种细胞凋亡通路失活, 并与癌症的发生、发展密切相关。在诱导凋亡的各种通路中, p53介导的凋亡通路在维持细胞稳定中起重要作用, 而该通路中DNA甲基化可导致该通路失活[19]。通过逆转 DNA甲基化激活肿瘤细胞中被抑制的 p53活性被认为是癌症治疗的可行方法之一[20,21]。有研究表明, 黑莓中的花青素对结肠癌细胞具有去甲基化作用[22]; BrMchR具有诱导A549细胞凋亡的作用, 其作用机制可能与其逆转 P53基因超甲基化作用有关[17]。本研究发现, 用蓝莓花青素处理KB细胞后, p53蛋白表达, 而且随着蓝莓花青素浓度增加 p53表达有所增加, 但是其中的机制并不明确, 有研究表明p53的DNA甲基化可以导致诱导凋亡的细胞通路失活[23,19], 因此本文从表观遗传学角度探讨蓝莓花青素诱导 KB细胞凋亡的机制是否与激活 KB细胞中被抑制的 p53活性有关, 利用MSP分析蓝莓花青素处理KB细胞后p53基因的甲基化情况的变化, 结果显示 p53基因的甲基化情况随着蓝莓花青素浓度的增加而降低, 说明蓝莓花青素能够逆转 p53基因高甲基化状态, 使其发生去甲基化, 从而恢复p53基因的表达。因此, 蓝莓花青素可能会成为一种很有潜力的去甲基化生物制剂, 但是还需要进行深入的研究来阐明其详细机制。

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(责任编委: 朱卫国)

Blueberry anthocyanins induce G2/M cell cycle arrest and apoptosis of oral cancer KB cells through down-regulation methylation of p53

Qi Chen , Shaowei Li, Yuchen Jia, Li Wang

Research Center of Molecular Biology, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, China

Blueberries are an excellent source of dietary polyphenols such as anthocyanins and phenolic acids. In this study, we investigated the ability of anthocyanins from the wild blueberries of Inner Mongolia to suppress the growth of the oral cancer cell line KB. The blueberry anthocyanins were extracted with methanol-containing 0.1% (v/v) hydrochloric acid. Fourteen unique anthocyanins were identified using high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS). The anticancer bioactivity of the extracts on KB cells was analyzed using methylthiazolyl-tetrazolium (MTT), flow cytometry (FCM) and immunocytochemistry. It was shown that the blueberry anthocyanins suppressed the proliferation of KB cells in a dose-dependent manner, as well as induced G2/M cell cycle arrest and apoptosis of oral cancer KB cells.Immunocytochemistry analysis showed that the expression of caspase-9 and cytochrome c were obviously increased after the anthocyanins treatment. Western blot analysis also indicated that the expression of p53 was increased. Methylation-specific PCR (MSP) showed that the amount of unmethylated p53 increased, indicating that the anthocyanins can down-regulate the methylation of p53.

anthocyanins; anticancer; blueberry; oral cancer; DNA methylation

2013-09-26;

2014-03-20

国家自然科学基金项目(编号：81341139)和内蒙古自然科学基金项目(编号：2013MS11100)资助

陈琦, 博士, 副研究员, 研究方向：天然产物抗肿瘤研究及表观遗传学。E-mail: yongqi-1@163.com

王利, 硕士, 讲师, 研究方向：分子生物学。E-mail: wangliwork@163.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0566

时间: 2014-4-24 8:59:46

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140424.0900.002.html