玉米钼辅助因子硫酸化酶基因启动子的克隆与功能验证

高学焕, 付凤玲, 牟巍, 周树峰, 张素芝, 李晚忱

四川农业大学玉米研究所, 成都 611130

玉米钼辅助因子硫酸化酶基因启动子的克隆与功能验证

高学焕, 付凤玲, 牟巍, 周树峰, 张素芝, 李晚忱

四川农业大学玉米研究所, 成都 611130

为克服组成型启动子启动外源基因过量表达引起的诸多问题，同源克隆(Mo-molybdopterin cofactor sulfurase)基因（ABA3）的启动子(ABA3s)序列，并用PlantCARE软件分析其非生物逆境应答元件, 实时定量PCR检测ABA3基因在非生物逆境诱导下的差异表达后。然后，用该启动子构建启动GUS（β-glucuronidase）基因的表达载体, 基因枪法转化玉米愈伤组织。经组织化学染色法检测其表达后, 在高渗、高盐、低温胁迫处理及ABA诱导下检测GUS酶荧光值与荧光素酶(内参)发光值的比值(GUS/LUC), 以此评价ABA3s启动子在非生物逆境胁迫下的启动活性。结果表明, ABA3基因在模拟干旱、低温、高温、高盐胁迫及ABA、乙稀诱导下差异表达, 说明该基因的启动子(ABA3s)具有非生物逆境诱导活性。序列分析表明, ABA3s启动子全长777 bp, 含有ARE、HSE、MBS、TGA、Circadian等多种非生物逆境胁迫应答元件。用ABA3s启动GUS基因构建的表达载体转化的玉米愈伤组织, 响应干旱、低温、高温、高盐胁迫等多种非生物逆境胁迫, 及ABA和乙稀诱导, GUS检测呈阳性。在8%甘露醇高渗条件下, GUS/LUC比值比空白对照高6倍。上述结果表明, ABA3s启动子具有非生物逆境诱导特性, 经进一步验证其功能后, 可用于玉米抗逆转基因研究。

玉米; 非生物胁迫; 钼辅助因子硫酸化酶; 启动子

干旱等非生物逆境是玉米(Zea mays)生产的主要限制因素[1]。增强玉米品种的耐旱性是克服干旱危害最为经济有效的方法。但是, 玉米是一个耐旱性较差的物种, 特别是拔节期遇干旱胁迫, 常引起雌雄花期不遇, 造成严重减产。虽然不同遗传型间也存在耐旱性的差异, 但不足以满足生产上对品种耐旱性的要求, 而且遗传性质非常复杂[2～5]。通过转基因操作转化利用外源耐旱基因, 是克服这一困难最有希望的途径[6～8]。但是, 在以往的研究中, 大多采用ubiquitin、CaMV35S、actin等组成型启动子启动耐旱基因的过量表达。在提高耐旱性的同时, 转基因株系的生长发育受到不同程度的抑制, 在非胁迫条件下难以发挥其丰产性能。如果选择适当的诱导型启动子, 只在干旱胁迫条件下启动外源耐旱基因表达, 就可以降低外源耐旱基因过量表达给玉米带来的适应性代价, 保证非胁迫条件下丰产性能的发挥[8,9]。Kasuga等[9]利用组成型启动子 CaMV35S启动DREB(Dehydration responsive element binding protein)基因转化拟南芥(Arabidopsis thaliana), 在改良抗逆性的同时, 引起植株矮化、生长畸形、籽粒减少等不良表现。改用诱导型启动子rd29A以后, 就避免了外源基因过量表达所带来的不良后果。再者,外源启动子在受体植物中对外源基因的启动效能可能不及内源启动子。例如, Yamaguchi-Shinozaki等[10]和Ono等[11]用水稻(Oryza sativa)非生物逆境诱导启动子 rab16A启动 GUS基因转化烟草(Nicotiana tabacum)和水稻, 在水稻中检测到的 GUS活性明显高于烟草。Rai等[12]对水稻的研究也证明, 有些可在非生物逆境诱导下启动内源基因表达的启动子, 并不能在转基因植物中启动外源抗逆基因表达。因此,在利用外源基因转化培育耐旱转基因玉米的研究中,除对耐旱外源基因本身的功能选择外, 还应注重选择适当的内源诱导型启动子, 既可在干旱胁迫条件下启动外源耐旱基因的表达, 提高玉米的耐旱性,又可在非胁迫条件下避免外源基因过量表达而引起的不良表现。然而, 因为玉米功能基因组研究比拟南芥和水稻等模式植物滞后, 关于玉米本身的非生物逆境诱导启动子克隆及功能验证鲜有报道。Buchanan等[13]克隆玉米 LEA(Late embryogenesis abundant)家族基因rab17(Aesponsive to abscisic acid 17)的启动子, 证实其可在外源脱落酸诱导下启动下游基因的表达。Cao等[14]从玉米中克隆具有脱落酸应答顺式作用元件ABRE(ABA response element)的转录因子基因 Vp1(Viviparous 1)的启动子, 构建瞬时表达载体, 基因枪法转化玉米营养组织韧皮部,证明可在干旱胁迫下启动 GUS和GFP(Green fluorescent protein)基因的表达。Wu等[15]克隆玉米磷脂酰乙醇胺 N-甲基转移酶基因 ZmPEAMT(Phosphoethanolamine N-methyltransferase gene), 发现其启动子区域包含高盐和高温应答元件, 可在非生物逆境胁迫启动下游基因表达。

本研究以拟南芥钼辅助因子硫酸化酶蛋白ABA3(Mo-molybdopterin cofactor sulfurase protein)的氨基酸序列为探针, 查找玉米基因组同源序列ABA3, 根据玉米ABA3基因序列用定量PCR引物设计软件Beacon Designer 7.0设计引物, 将玉米自交系“178”二叶期幼苗水培至四叶期, 分别用模拟干旱、高盐、高温、低温胁迫处理以及脱落酸(Abscisicacid, ABA)、乙烯诱导, 经实时定量PCR验证ABA3基因在非生物逆境胁迫下的差异表达后, 用PlantCARE软件分析并同源克隆其上游启动子序列ABA3s, 构建ABA3s启动GUS基因的表达载体, 用基因枪法转化玉米胚性愈伤组织, 经GUS染色检测其是否启动表达后, 在高渗、高盐、低温处理及ABA诱导下, 检测GUS酶荧光值与荧光素酶发光值的比值(GUS/LUC), 以此评价 ABA3s启动子在非生物逆境胁迫下的启动活性, 以期为玉米抗逆转基因玉米研究提供更多的选择。

1 材料和方法

1.1 玉米ABA3基因在非生物胁迫条件下的差异表达

以拟南芥ABA3 (ABA DEFICIENT 3)蛋白质的氨基酸序列(NP_564001)为探针[16], 用 NCBI(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的在线软件tblastn搜索同源蛋白质的 mRNA序列, 与玉米“B73”基因组序列比对(BLAST), 查找同源序列。

取玉米自交系“178”种子, 用10% NaClO消毒后, 在蛭石：珍珠岩(3∶1)基质中发芽至二叶期, 转移至改良的Hoagland营养液培养至四叶期[17], 分别用 16%聚乙二醇-6000(Polyethylene glycol-6000, PEG-6000)模拟干旱[18]和高盐(200 mmol/L NaCl)处理 72 h, 低温(4℃)和高温(42℃)处理 24 h, 以及ABA(100 μmol/L)和乙烯(100 μmol/L乙烯利)诱导24 h, 3次重复。在模拟干旱、高盐处理的0、12、24、48、72 h和ABA、乙烯、低温、高温处理的0、2、6、12、24 h取样, 用Trizol试剂盒(TaKaRa, 日本)提取总 RNA, 再用 PrimeScriptTM试剂盒(TaKaRa,日本)反转录成 cDNA, 稀释 5倍后作为实时定量PCR(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)的模板。

用定量 PCR引物设计软件 Beacon Designer 7.0(http: //www.premierbiosoft.com)设计引物(5′-TGAAGCGTCTGAATGGTT-3′; 5′-GAAGCAATCGGTGAACAT-3′), 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以玉米18S基因作内参, 10 μL反应体系包括：SsoFast EvaGreen supermix(Bio-Rad, 美国)5.0 μL、上下游引物(10.0 μmol/L)各0.5 μL和稀释的cDNA 1.0 μL。在CFX96定量PCR仪(Bio-Rad, 美国)上, 温度循环为：98℃预变性2 min; 98℃变性2 s, 50℃～65℃复性10 s, 循环44次。然后, 以每步0.01 s、 0.5℃的梯度升高至95℃, 绘制熔解曲线。采用双标准曲线法对 ABA3基因的表达水平进行相对定量测定, 计算不同处理时间ABA3基因表达量相对于0 h对照的倍数。

1.2 玉米 ABA3s启动子序列生物信息学预测与同源克隆

用植物启动子序列分析软件 PlantCARE(http: //bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare), 查找分析ABA3基因编码序列上游1.5 kb区域内CAAT框和 TATA框等启动子序列特征, 确定转录起始位点。据此设计特异PCR引物(5′-AAGCTT TGGATGGCTGATGGAGTCTCTTGT-3′); 5′-GGATCC GGGCGGTGGCGGCATTTAGTA-3′), 并在其 5′端引入构建载体所需的限制性酶 HindⅢ/BamHⅠ识别位点(下划线), 以玉米自交系“B73”基因组DNA为模板, 用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa, 日本)扩增 ABA3s启动子序列, 经琼脂糖凝胶电泳分离后, 回收纯化 777 bp的目的片段,用HindⅢ/BamHⅠ双酶切后再次分离、回收和纯化。

1.3 ABA3s启动GUS基因表达载体的构建

用 HindⅢ/BamHⅠ双酶切植物表达载体pBI221-UbiGUS, 分离、回收和纯化后加入上一步骤回收纯化的ABA3s启动子片段, 用T4 DNA 连接酶(TaKaRa, 日本)连接, 构建ABA3s启动GUS基因的表达载体(图 1), 用 42℃热激法转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株(上海生工生物工程技术服务有限公司)的感受态细胞, 在加有氨苄青霉素(Biobasic Inc., 加拿大)的抗性培养基上筛选阳性重组子, 经菌液 PCR和扩大培养后提取质粒, 并用HindⅢ/BamHⅠ双酶切进行检测, 由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.4 玉米愈伤组织的基因枪法转化

参照Fu等[19]报道的方法, 在授粉后12 d左右,取玉米自交系齐“319”长1.5～2.0 mm的幼胚, 接种于改良的 N6诱导培养基[N6盐+蔗糖 3%+琼脂0.7%+2,4-D 2 mg/L+L-脯氨酸1.38 g/L+水解酪蛋白500 mg/L+烯效唑(S3307)0.25 mg/L, pH 5.8～6.0], 27℃黑暗培养, 诱导愈伤组织的发生。按照 Armstrong和 Green[20]提出的标准, 挑选胚性愈伤组织,转接于改良的N6继代培养基(N6盐+蔗糖3%+琼脂0.7+2,4-D 1 mg/L+L-脯氨酸 0.69 g/L+水解酪蛋白100 mg/L+甘露醇20 g/L, pH5.8～6.0), 27℃暗培养增殖。

图1 玉米ABA3s启动子启动GUS基因的表达载体pBI221-ABA3sGUS

取浓度为 1 μg/μL的 ABA3s诱导表达载体pBI221-ABA3sGUS和组成型启动子ubiquitin启动荧光素酶基因LUC(Luciferase)的表达载体pUbiLUS(内参对照)质粒DNA各2.25 μL和0.75 μL, 加20 μL亚精胺(0.5 mol/L)和50 μL CaCl2(2.5 mol/L)沉淀到3 mg用乙醇和无菌蒸馏水反复洗涤的金粉(60 mg/mL,金粉·甘油)上, 涡旋震荡并用70%乙醇(HPLC级)洗涤后, 加入60 μL无水乙醇, 涡旋震荡并超声波处理使金粉分散悬浮。在DuPont PDS1000/He型基因枪(Bio-Rad, 美国)上, 以1100 psi系统压力和28英寸汞柱真空度, 每枪1.0 μg/mg(质粒/金粉), 转化在N6高渗培养基上预培养 4 h的玉米胚性愈伤各 10皿,每皿100块愈伤。

1.5 ABA3s启动GUS基因瞬时表达的定量检测

将转化后的愈伤组织转移到继代 N6培养基上, 27℃黑暗培养 2 d后, 选大小、形状基本一致的ABA3s诱导表达载体pBI221-ABA3sGUS和内参对照质粒pUbiLUC转化的愈伤各分为15皿, 每皿50块愈伤, 分别实施 8%甘露醇模拟高渗处理、200 mmol/L NaCl高盐处理、100 μmol/L ABA诱导和4℃低温处理24 h, 以及空白对照各3皿(生物学重复)。每皿取5块愈伤, 用Jefferson等[21]介绍的方法染色,在解剖显微镜下观察照像。其余愈伤转‒70℃预冷研钵, 加荧光素酶检测系统稀释成1×细胞裂解液1700 μL研磨成匀浆, 转入2 mL离心管中, 12 000 r/min离心10 min。各取100 μL上清液, 转入1.5 mL离心管, 加100 μL预热至37℃的GUS反应缓冲液, 混匀后立即吸取100 μL加到1900 μL反应终止液中, 在Fluoroskan Ascent FL型荧光/化学发光微孔读数仪(Thermo Scientific, UK)上用 355 nm激发光和 460 nm发射光条件下检测0 h(对照)的本底荧光值。然后将剩余反应液体在37℃反应2 h后, 立即加入1900 μL反应终止液, 再用同样方法检测总荧光值。GUS酶荧光值=总荧光值-本底荧光值。

另取50 μL上述每种处理及空白对照的上清液,转至 96孔板, 加荧光素酶检测系统(Promega, 北京)LUC反应液 100 μL混匀, 立即在 Fluoroskan Ascent FL型荧光/化学发光微孔读数仪(Thermo Scientific, 美国)上, 检测延迟12 s的荧光素酶发光值。参照Koo等[22]介绍的方法, 用GUS酶荧光值与荧光素酶发光值的比值作为表达量, 以此评价启动子在非生物逆境胁迫条件下的启动活性。

2 结果与分析

2.1 玉米ABA3基因在非生物胁迫条件下差异表达

qRT-PCR分析表明, ABA3基因的表达对PEG模拟干旱、低温、高温、高盐胁迫, 以及ABA和乙稀诱导均有响应(图2), 方差分析表明不同胁迫时间段的表达量与对照(0 h)之间的差异达极显著水平(F模拟干旱= 88.317, P＜0.01; F低温=66.429, P＜0.01; F高温=17.048, P＜0.01; F高盐=143.325, P＜0.01; FABA=84.950, P＜0.01; F乙稀=52.834, P＜0.01)。其中, 在PEG模拟干旱和低温胁迫下呈现下调表达, 在高温、高盐胁迫和ABA、乙稀诱导下呈现上调表达。由此推测, 玉米ABA3基因的启动子ABA3s很可能具有非生物逆境启动活性。

2.2 玉米ABA3s启动子序列

图2 玉米ABA3基因在非生物逆境胁迫下的相对表达量A：16%聚乙二醇-6000模拟干旱处理; B：低温(4℃)处理; C：高温(42℃)处理; D：高盐(200 mmol/L NaCl)处理; E：ABA(100 μmol/L)诱导; F：乙烯(100 μmol/L乙烯利)诱导。

以拟南芥 ABA3蛋白质氨基酸序列(NP_564001)为探针, 在 NCBI数据库中搜索到的玉米同源蛋白为钼辅助因子硫酸化酶(Mo-molybdopterin cofactor sulfurase, NP_001148545), 其mRNA序列的GenBank登录号为NM_001155073。通过BLAST比对发现该序列与玉米“B73”基因组AGPv1版本的第二染色体Chr2: 195668928-195674932碱基序列的同源性为98%, 所以在玉米基因组 AGPv1版本上定位为：Chr2: 195668928: 195674932。在其编码序列上游1.5 kb以内, 除-75 bp的CAAT框和-30 bp的TATA框以外, PlantCARE分析还发现对厌氧、热激、干旱等非生物胁迫条件的应答元件, 以及生长素、生理节律调控应答元件和抗逆相关转录因子 MYB的结合位点(表 1)。根据生物信息学分析结果设计的特异PCR引物, 以玉米自交系“B73”基因组DNA为模板,扩增到的片段约长 780 bp, 测序结果为 777 bp(图3)。与玉米基因组序列比对发现, ABA3基因的上游800 bp即是另一个基因(EU947057.1)的3′端。由此可知, 扩增所得777 bp即是ABA3s启动子的全长序列。

2.3 ABA3s启动GUS基因在胁迫条件下瞬时表达

将上述扩增所得777 bp DNA连接pBI221载体片段, 构建成 ABA3s启动 GUS基因的表达载体pBI221-ABA3sGUS, 经酶切鉴定和序列测定正确后,用以转化玉米愈伤组织。在100 μmol/L ABA诱导、8%甘露醇模拟高渗处理、4℃低温处理和 200 mmol/L NaCl高盐胁迫条件下, GUS染色均可显现靛蓝色斑点, 而空白对照没有显现, 说明 ABA3s启动子确有非生物逆境诱导启动功能(图4)。

为克服基因枪散弹转化的随机性, 参照Koo等[22]介绍的方法, 将pBI221-ABA3sGUS和pUbiLUS质粒混合转化的愈伤组织经胁迫处理及GUS反应后, 检测 GUS酶荧光值(GUS), 再除以荧光素酶发光值(LUC), 消除转化率差异的影响, 用 GUS/LUC比值评价ABA3s启动子受非生物逆境诱导启动基因表达的相对活性。结果表明, 在8%甘露醇模拟高渗条件下 ABA3s的启动活性最高, GUS/LUC比值达 6.04,比空白对照高 6倍。方差分析的 F＝209.429, P＜0.015, 但多重比较表明, 在200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA诱导和4℃低温处理下, ABA3s的启动活性与空白对照无显著差异(图5)。

表1 玉米ABA3s启动子的非生物逆境胁迫应答元件

图3 玉米ABA3s启动子序列及非生物逆境胁迫应答元件用阴影显示的碱基与模式植物的同源序列相比有突变, 但通过PlantCARE软件分析并不影响元件。

图4 pBI221-ABA3sGUS转化玉米愈伤组织GUS的染色a：100 μmol/L ABA; b：8%甘露醇; c：4℃; d：200 mmol/L NaCl; e：空白对照。

图5 ABA3s启动下GUS基因在非生物胁迫条件下瞬时表达

3 讨 论

用 PlantCRAE分析启动子序列, 显示玉米ABA3s启动子中含有 ARE、HSE、MBS、TGA和Circadian非生物逆境胁迫应答元件(表 1)。其中, ARE是ABA应答的核心元件。ABA3s启动的内源ABA3基因, 在高温、高盐胁迫和ABA、乙稀诱导下呈现上调表达(图2)。先前的研究也表明, ABA可诱导多种抗逆相关基因的表达, 在植物非生物胁迫应答中起重要作用[23～26]。HSE和 MBS元件与植物对高温、高盐等多种非生物胁迫的应答有关[27,28], 可能是高温、高盐胁迫下ABA3s启动内源ABA3基因上调表达的原因之一(图2)。

本研究对玉米 ABA3s启动子序列分析(表 1),ABA3基因在PEG模拟干旱、低温、高温、高盐胁迫和 ABA、乙稀诱导下的差异表达(图 2), 以及ABA3s启动GUS基因转化玉米愈伤组织在胁迫条件下的瞬时表达(图 4, 图 5)这几个方面, 均证明ABA3s启动子响应多种非生物逆境胁迫和诱导, 启动下游基因的表达, 可运用于玉米抗逆转基因研究。值得注意的是, ABA3s启动GUS基因转化玉米愈伤组织在 8%甘露醇模拟干旱胁迫下的表达活性,比空白对照高6倍, 在高盐、ABA诱导和低温处理下, ABA3s的启动活性与空白对照无显著差异(图5)。然而, qRT-PCR分析表明, ABA3s启动的内源ABA3基因, 在高温、高盐胁迫和ABA、乙稀诱导下呈现上调表达(图2), 而在PEG模拟干旱和低温胁迫下却呈现下调表达(图2)。但是, Lu等[29]用拟南芥钼辅助因子硫酸化酶基因(LOS5)转化玉米, 通过对内源醛氧化酶基因表达的上调促进ABA的积累, 降低气孔导度和水份散失, 显著提高转基因株系的耐旱性。醛氧化酶催化 ABA生物合成的最后一步——脱落酸醛的氧化[30]。关于ABA3s启动子及其启动的ABA3基因, 在不同的胁迫条件下启动活性及表达模式与其他模式植物的同源基因不完全一致的情况, 可能是因为不同物种对各种非生物逆境的响应机制不完全相同所致, 而玉米ABA3s启动子在非生物逆境胁迫下的启动活性确在本研究的几个不同的方面得以验证, 并与前人的报道基本一致。

在上述各种实验处理的不同时间段, 基因表达量的不规律性波动, 也说明玉米抗逆相关基因表达调控网络对非生物逆境的应答是多方面而且复杂的。本研究所用的启动子分析软件 PlantCARE, 在ABA3s启动子序列中未发现低温应答元件, 但qRT-PCR分析和 GUS基因瞬时表达实验均证明ABA3s启动子具有低温启动活性, 说明其序列中可能还存在未被认识的低温应答元件。

玉米钼辅助因子硫酸化酶基因 ABA3的启动子ABA3s长777 bp, 含有ARE、HSE、MBS、TGA和Circadian非生物逆境胁迫应答元件, 响应干旱、低温、高温、高盐胁迫等多种非生物逆境胁迫, 及ABA和乙稀诱导, 启动下游基因的表达, 经进一步验证后可运用于玉米抗逆转基因研究。

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(责任编委: 王国英)

Cloning and functional validation of promoter of mo-molybdopterin cofactor sulfurase gene in maize

Xuehuan Gao, Fengling Fu, Wei Mu, Shufeng Zhou, Suzhi Zhang, Wanchen Li

Maize Research Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China

To overcome the problems caused by the over-expression of exogenous genes under the control of constitutive promoters, the promoter (ABA3s) sequence of maize (Zea mays) mo-molybdopterin cofactor sulfurase gene (ABA3) was cloned homologously, analyzed for its abiotic stress-responsive elements by the PlantCARE software, and detected for differential expression of the ABA3 gene under the abiotic stresses by real-time quantitative PCR. Then, this promoter was used to construct expression vector to start GUS (β-glucuronidase) gene, and transform maize calli by biolistics. After identification by histochemcal staining, the ratio of the GUS activity relative to the luciferase activity (internal control)(GUS/LUC) was measured under the stresses of hypertonic, high salt, low temperature, and the induction of ABA, and used to evaluate the activity of the ABA3s promoter in response to abiotic stresses. The results showed that the ABA3 gene was differentially expressed under the stress of simulative drought, low temperature, high temperature, high salt, and the induction of ABA and ethylene, indicating that the promoter (ABA3s) of this gene is induced by abtiotic stress. The sequence analysis showed that the ABA3s promoter is 777 bp long, and contains abiotic stress-responsive elements ARE, HSE, MBS, TGA and circadian. The transformed calli by the expression vector of the GUS gene under the control of the ABA3s promoter showed positive in GUS detection in response to the abiotic stresses of drought, low temperature, high temperature, high salt, and the induction of ABA and ethylene. The GUS/LUC ratio was six folds higher than the blank control under the hypertonic stress of 8% mannitol. It is concluded that the promoter ABA3s is inducible in response to abiotic stresses, and might be applied to transgenic research of maize for abiotic tolerance after further functional evaluation.

maize; abiotic stress; mo-molybdopterin cofactor sulfurase; promoter

2013-09-30;

2014-01-02

国家转基因重大科技专项(编号：2013ZX08003-005)资助

高学焕, 硕士研究生, 专业方向：植物分子生物学。E-mail: gaoxh2011@qq.com

李晚忱, 教授, 博士生导师, 研究方向：玉米遗传育种与生物技术。E-mail: aumdyms@sicau.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0584

时间: 2014-3-7 11:37:59

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140307.1137.002.html