利用染色体区段混合BAC探针鉴定食管癌细胞中的染色体畸变

郝佳洁, 王春丽,2, 顾文跃,3, 程潇钰, 张钰, 徐昕, 蔡岩, 王明荣

1. 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所, 分子肿瘤学国家重点实验室, 北京 100021;

2. 安徽医科大学组织胚胎学教研室, 合肥 230032;

3. 盐城市第三人民医院病理科, 盐城 224001

利用染色体区段混合BAC探针鉴定食管癌细胞中的染色体畸变

郝佳洁1, 王春丽1,2, 顾文跃1,3, 程潇钰1, 张钰1, 徐昕1, 蔡岩1, 王明荣1

1. 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所, 分子肿瘤学国家重点实验室, 北京 100021;

2. 安徽医科大学组织胚胎学教研室, 合肥 230032;

3. 盐城市第三人民医院病理科, 盐城 224001

染色体畸变是恶性肿瘤细胞的重要遗传学特征, 文章旨在应用BAC DNA克隆鉴定食管癌细胞中的染色体臂和染色体区段的畸变。针对染色体各区段选取5～10个1 Mb BAC DNA, 分别混合制备成特定染色体区段的BAC DNA混合克隆, 然后将染色体臂上覆盖所有区段的上述混合克隆进一步混合制备成特定染色体臂BAC DNA混合克隆。利用简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(Degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR)标记染色体臂探针, 利用切口平移法(Nick translation)标记染色体区段探针, 并对食管癌细胞中期染色体进行荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)分析。正常人外周血淋巴细胞中期染色体FISH结果显示, 上述方法标记的探针具有较高的特异性。进一步利用染色体臂混合探针, 确定了多个食管癌细胞中的染色体重排所涉及的特定染色体臂; 利用染色体区段混合探针, 鉴定出KYSE140的t(1q;7q)衍生染色体中1q上的断点范围位于1q32-q41。文章成功建立了1 Mb BAC DNA混合克隆探针标记技术, 并鉴定出多个食管癌细胞中的染色体臂和染色体区段畸变, 不仅为利用 M-FISH技术鉴定肿瘤细胞中的染色体畸变提供了更为准确的方法, 而且还可能进一步将该法推广应用于恶性血液病的核型分析以及产前诊断。

染色体畸变; BAC DNA; 染色体臂和区段; 荧光原位杂交; 食管癌细胞

染色体畸变是恶性肿瘤的重要特征, 染色体畸变的鉴定和分析已成为恶性肿瘤研究的重要领域之一。多色荧光原位杂交(Multicolor fluorescence in situ hybridization, M-FISH)/光谱核型分析(Spectral karyotyping, SKY)技术能够用于一次性筛查和鉴定恶性血液病和实体瘤细胞系的全基因组染色体畸变, 特别是对于检测恶性血液病的染色体重排具有显著优越性[1～5], 但由于 M-FISH/SKY技术的分辨率有限,所以通常鉴定出的畸变范围相对较大。近年来的研究表明, 恶性实体肿瘤细胞系的核型相对比较复杂,因此单独使用M-FISH/SKY鉴定恶性实体肿瘤细胞的染色体畸变具有较大难度。若能辅以其他精确度更高的技术方法, 才可能相对准确、有效地鉴定出恶性实体瘤细胞系核型。例如, 基于微阵列的技术以及新一代测序技术等[4,6～10]。

食管癌是发病率和死亡率较高的常见恶性实体瘤之一, 我国食管癌的主要类型为食管鳞癌[11,12]。本实验室在前期研究中利用染色体水平的比较基因组杂交(Comparative genomic hybridization, CGH)、微阵列比较基因组杂交(Array-CGH)和M-FISH技术在多个食管癌细胞系中检测到染色体畸变, 且这些细胞系的核型非常复杂[13～16], 因此开发能够与 M-FISH和 array-CGH配合用于鉴定染色体畸变的技术, 对于进一步明确细胞系的核型是十分必要的。

本文以食管癌细胞系为模型, 建立了一种简便的染色体臂/区段 M-FISH检测技术, 且费用相对低廉。利用实验室现有的1 Mb BAC DNA克隆, 制备了多种混合克隆模板, 鉴定出多个食管癌细胞系中特定的染色体臂或染色体区段畸变。

1 材料和方法

1.1 食管癌细胞系

人类食管鳞癌细胞系 KYSE30、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE410、KYSE450和KYSE510由日本东京大学Shimada教授惠赠。细胞培养使用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培养基(Invitrogen公司), 在37℃含5% CO2的培养箱中培养。

1.2 中期染色体和间期核细胞悬液的制备

取正常人外周血0.5 mL接种至含有肝素的培养基, 37℃培养2 d, 制备正常人外周血淋巴细胞中期染色体。正常人外周血淋巴细胞和食管癌细胞系经0.04 µg/mL秋水仙胺(Invitrogen公司)处理1～2 h后,收获细胞。0.075 mol/L KCl重悬细胞, 37℃水浴30 min, 加入100 µL固定液(甲醇:冰醋酸=3:1), 吹打混匀, 1000 r/min离心10 min, 弃上清。加入10 mL固定液重悬, 室温放置20 min, 1000 r/min离心10 min,弃上清, 重复两次, 1 mL固定液重悬。取10 µL悬液滴至载玻片上, 室温晾干, 并在干燥器中放置2～3 d后进行杂交前处理。剩余的细胞悬液置于-20℃保存备用。

1.3 BAC DNA质粒提取

BAC DNA 质粒提取使用 Wizard® Plus SV minipreps DNA Purification System(Promega公司),操作步骤详见说明书。

1.4 染色体区段和染色体臂涂染探针模板的制备

根据染色体区段的长度, 在各区段选取5～10个1 Mb BAC DNA克隆进行混合, 制备成各染色体区段混合BAC DNA克隆。进一步利用上述区段混合克隆继续混合, 制备特定染色体臂的 BAC DNA混合克隆。例如, 总共105个1 Mb BAC DNA克隆定位于1号染色体长臂(1q), 根据各BAC DNA克隆在1q上的具体位置, 将1q上的BAC DNA分段混合,制备成 18个区段, 包括 1q11-q21、1q21-q22、1q22-q23、1q12-q24、1q23-q25、1q24、1q22-q25、1q25-q31、1q25.3-q31.1、1q31-q32、1q25-q31.3、1q31.3-q32.1、1q32、1q32-q41、1q32.3-q41、1q41-q42、1q43和1q43-q44。将上述18个区段混合BAC DNA全部混合, 制备成能够覆盖 1q的染色体臂 BAC DNA混合克隆。其他染色体区段和染色体臂探针模板按照相同的方法制备。

1.5 BAC DNA模板片段化和探针标记

BAC DNA通过DOP-PCR的低严谨性扩增方法进行片段化和扩增, 体系如下(50 µL)：5.0 µL 10× buffer (Mg2+), 4.0 µL MgCl2(25 mmol/L), 1.0 µL DOP-PCR 引物 (100 µmol/L), 2.0 µL dNTP (5 mmol/L), 1.0 µL模板(50 ng), 36.5 µL ddH2O, 0.5 µL rTaq (5 U/µL); DOP-PCR引物序列为： 5′-CCGACTCGAGNNNNNNTAGGAG-3′。扩增程序：94℃ 3 min; 94℃ 1.5 min, 30℃ 2.5 min, 以0.1℃/s的速度升至 72℃, 72℃ 3 min, 8个循环; 94℃ 1 min, 62℃ 1.5 min, 72℃ 2 min(各循环的延伸时间在前一循环的基础上增加1 s), 30个循环; 72℃ 10 min。

随后对片段化的模板进行 DOP-PCR高严谨性扩增, 体系同上, 反应程序如下：94℃ 3 min; 94℃1 min, 62℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 重复30个循环; 72℃ 8 min。

探针标记所需底物包括Cy3-dUTP(GE Healthcare公司)、SpG-dUTP(Abbott Molecular公司)、Alexa 594-dUTP(Invitrogen公司)、Biotin-dCTP(Invitrogen公司)。染色体臂混合BAC DNA利用DOP-PCR高严谨性扩增标记。标记体系如下(25 µL)：2.5 µL 10× buffer (Mg2+-free), 2.0 µL MgCl2(25 mmol/L), 0.5 µL DOP-PCR引物 (100 µmol/L), 2.0 µL dNTP (2.5/1.25 mmol/L), 0.5 µL模板, 8.0 µL dUTP/dCTP (125 µmol/L), 9.25 µL ddH2O, 0.25 µL rTaq (5 U/µL); 反应程序如下：94℃ 3 min; 94℃ 1 min, 62℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 重复30个循环; 72℃ 8 min。染色体区段混合BAC DNA按照Nick translation kit(Abbott Molecular公司)中提供的程序进行。

1.5 荧光原位杂交

标记后的探针各取3 µL, 加入6 µL Cot-I DNA和6 µL鲑鱼精DNA, 1/10体积3 mol/L醋酸钠, 2.5倍体积预冷的无水乙醇, -20℃放置30 min, 12 000 r/min离心15 min, 弃上清。加入500 µL 75%乙醇清洗一次, 12 000 r/min离心10 min, 弃上清, 室温晾干, 10 µL杂交液(50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、1% Tween-20、2×saline sodium citrate [SSC])溶解, 待用。

样品片前处理：在1× PBS中清洗5 min, 梯度乙醇脱水(75%、85%、100%, 各 3 min), 晾干。用RNase A(100 mg/mL溶解于2× SSC)湿盒中37℃处理40 min, 2× SSC中3 min, 重复一次, 梯度乙醇脱水, 晾干。玻片继续经pepsin(50 mg/mL溶解于0.01 mol/L HCl)37℃处理10 min, 1× PBS中清洗5 min, 1%多聚甲醛10 min, 1× PBS清洗5 min, 梯度乙醇脱水, 晾干。

探针 75℃变性 8 min, 立即置于冰上 2 min, 37℃预复性30 min。前处理后的玻片置于70%甲酰胺/2× SSC中, 73℃～75℃变性3 min, 预冷的2×SSC中2次, 每次3 min, 梯度乙醇脱水, 晾干。将含有探针的10 µL杂交液滴加于玻片, 覆以18 × 18 mm盖玻片, 橡皮胶封片, 置于湿盒中, 37℃保温24～48 h。杂交后玻片置于 50%甲酰胺/2× SSC, 43℃洗片 15 min, 2× SSC中3 min, 重复一次, 梯度乙醇脱水, 晾干, 1 mg/mL 40,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)封片。对于标记了Biotin-dCTP的探针, 在探针洗涤后增加以下步骤：4× SSCT清洗5 min, 3% BSA(于4× SSCT中溶解)湿盒中37℃处理30 min, 4× SSCT清洗5 min, Cy5-Streptavidin(Jackson ImmunoResearch,4× SSCT稀释至 1:200)湿盒中 37℃处理 1 h, 4× SSCT清洗5 min, 重复2次, 梯度乙醇脱水, 晾干, DAPI封片。

1.6 显微镜检和图像分析

FISH图像利用蔡司 Axio荧光显微镜观察, 并通过数码冷CCD(Princeton Instruments公司)进行采集。所有荧光信号均使用单通道滤光片采集, 然后利用 MetaMorph(Universal Imaging公司)进行图像处理。

2 结果与分析

2.1 利用1 Mb BAC DNA克隆自制染色体区段和染色体臂涂染探针模板

选取染色体臂上的 1 Mb BAC进行分段混合,总共制备了537个区段BAC DNA混合克隆。由于相邻混合克隆之间存在重叠, 因此这些混合克隆能够覆盖整个染色体组中的各个区段, 从而保证后续图像采集时呈现均匀的杂交信号。进一步利用染色体臂上的区段混合克隆继续混合, 制备了总共42个染色体臂的BAC DNA混合克隆涂染探针模板。由于13、14、15、21、22和Y染色体为近端着丝粒染色体, 因此仅制备了其长臂探针模板; 而对于其余染色体, 均分别制备了长臂和短臂探针模板。

2.2 自制染色体臂涂染探针的特异性分析

利用DOP-PCR低严谨性扩增方法对混合BAC DNA进行片段化和富集, 进一步通过DOP-PCR高严谨性扩增法对片段化产物进行标记。电泳结果显示, 使用 SpG-dUTP、Alexa 594-dUTP、Cy3-dUTP和 Biotin-dUTP标记的 2、3、4、5、6、8、9、12和16号染色体臂混合BAC DNA探针大小范围为200～2000 bp(图1)。正常人外周血淋巴细胞中期染色体FISH结果显示, 上述染色体臂涂染探针具有较高的特异性(图2)。

2.3 利用自制染色体臂涂染探针鉴定食管癌细胞中的染色体畸变

利用自制染色体臂涂染探针对多个食管癌细胞系进行了 FISH检测, 结果显示 KYSE450中存在t(2q;16p)和t(2q;16q)、KYSE410中存在t(4q;8q)、以及KYSE180中存在t(2p;?;3p)(图3：A～C)。

在本实验室前期研究中, 食管癌KYSE450细胞array-CGH结果显示, 该细胞存在2p24.2-q13和16号染色体增益, 且2号染色体上2p24.2和2q13区段具有明显断点, 而16号染色体未检测到明显断点[16]。结合上述结果, 本研究推测图3A中所示的与16q发生重排的片段是2p24.2-q13, 且连接点位于2q13。

KYSE180中3p涂染探针FISH结果显示, 3p存在4个信号, 其中2个小信号位于t(2p;?;3p)衍生染色体上。

同时, 本文还检测了食管癌细胞 KYSE30、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE450和KYSE510,将大量染色体重排定位至特定的染色体臂(图3D)。

2.4 联合染色体臂涂染探针和区段探针鉴定食管癌中的染色体重排

已证实KYSE140中存在t(1q;7q)衍生染色体(图3), 为了进一步确定1q的断点范围, 本研究利用1q上的染色体区段探针和 7q染色体臂涂染探针进行FISH检测, 结果显示1q25-q31与7q不在一条染色体上, 而1q32-q41、1q41-q42和1q43-q44与7q在同一条染色体上, 且1q32-q41与7q距离最近, 因此推测1q上的断点位于1q32-q41(图4)。

图2 自制染色体臂涂染探针的特异性验证代表图正常人外周血淋巴细胞中期染色体FISH结果表明, 2p、2q、3p、3q、4p、4q(A)以及6p、6q、8p、8q、16p、16q(B)均显示两个信号。上述探针标记使用的荧光素和伪彩分别为2p(SpG, 绿色)、2q(Cy3, 红色)、3p(Alexa 594, 紫色)、3q(Biotin/Cy5, 蓝色)、4p(SpG和Cy3,黄色)、4q(SpG和Alexa 594, 粉绿色)、6p(SpG, 绿色)、6q(Cy3, 红色)、8p(Cy3和Biotin/Cy5, 粉色)、8q(Alexa 594和Biotin/Cy5, 粉蓝色)、16p(Alexa 594, 紫色)和16q(Biotin/Cy5, 蓝色)。

图3 利用染色体臂涂染探针检测食管癌细胞中的染色体畸变A：KYSE450中存在t(2q;16p)(上方白色箭头所示)和t(2q;16q)(下方白色箭头所示); 探针标记使用的荧光素和伪彩分别为2p(SpG, 绿色)、2q(Cy3, 红色)、16p(SpG和Cy3, 黄色)和16q(Biotin/Cy5, 蓝色); B：KYSE410中存在t(4q;8q)(白色箭头所示); 探针标记使用的荧光素和伪彩分别为4p(SpG和Cy3, 黄色)、4q(SpG, 绿色)、8p(Cy3和Biotin/Cy5, 粉色)和8q(Biotin/Cy5, 紫色); C：KYSE180中存在 t(2p;?;3p)(两个白色箭头所示); 探针标记使用的荧光素和伪彩分别为 2p(SpG, 绿色)和 3p(Cy3, 红色); D：各细胞系中鉴定出的染色体臂重排。

图4 联合染色体臂和区段探针鉴定KYSE140细胞中t(1q;7q)衍生染色体上1q的断点范围A：1q41-q42(红色)和1q43-q44(绿色)均与7q(蓝色)位于同一条衍生染色体上; B：1q32-q41(绿色)和7q(蓝色)位于同一条衍生染色体上,而1q25-q31(红色)则不在该染色体上。这些结果提示, 1q上的断点范围位于1q32-q41。

3 讨 论

本文利用实验室现有的BAC DNA克隆库, 自行制备出针对各染色体臂的涂染探针模板, 荧光原位杂交实验结果表明, 探针具有较高的特异性, 且有效地检测出了食管癌细胞中的染色体臂畸变。

M-FISH/SKY是鉴定恶性血液病和恶性实体瘤细胞全基因组染色体畸变的方法之一, 而考虑到恶性实体瘤细胞核型的复杂性, 单独使用 M-FISH/ SKY可能使鉴定结果产生一定误差。近年来, M-FISH/ SKY联合染色体臂区段mBAND FISH、array-CGH等技术, 使染色体畸变鉴定的精确度大大提高。mBAND是一种多色显带技术, 运用显微切割技术分离染色体片段, 通过多色标记, 从而使区段按不同颜色得以区分, 已有研究表明, 该法能够鉴定出重排、缺失等染色体畸变[17～22]。由于显微切割法对实验人员的技术操作要求较高, 从而增加了自行制备mBAND模板的难度。本文建立的混合BAC DNA探针同样能够将染色体畸变定位于特定的染色体臂和染色体区段, 无需对染色体区段进行显微切割,操作相对简便, 费用相对低廉, 同时可以根据实际需要将不同区段的克隆混合作为模板。Array-CGH是鉴定基因组拷贝数畸变和非平衡断点的常用方法[5,6,23,24]。对于利用 array-CGH鉴定出的非平衡断点, 通常需要经过原位验证, 利用 BAC DNA探针FISH能够实现这一点; 对于利用array-CGH检测不出的平衡断点, 本文建立的方法还能够帮助确定是否具有重排以及涉及的断点范围, 从而增加了染色体畸变鉴定的准确性。

1 Mb BAC DNA相邻BAC DNA之间的平均间隔为1 Mb。由于荧光素被激发产生荧光后具有散射效应, 因此我们推测, 虽然BAC DNA之间有间隔,但当 BAC DNA混合在一起后, 发射出的荧光仍能覆盖该区域。本文的FISH结果表明, 标记的1 Mb BAC DNA混合染色体臂涂染探针的FISH信号是比较均匀的。

目前标记单个BAC DNA探针常用的方法主要包括随机引物法和切口平移法[25]。本研究首先尝试利用上述两种方法对混合 BAC DNA进行了标记,而FISH结果显示, 当数个BAC DNA混合后, 标记和杂交的效率则显著下降, 杂交后的信号会受到明显影响, 尤其对于混合了几十个 BAC DNA的染色体区段和整条染色体臂, 上述两种方法标记的探针均无明显杂交信号。因此本文改用DOP-PCR方法对混合BAC DNA进行片段化和扩增。DOP-PCR最初用于扩增和标记染色体涂染探针, 其所用模板是通过流式分选或显微切割获得的染色体和染色体片段[26,27]。近年来, DOP-PCR也被扩展用于BAC DNA的标记以及微阵列探针的制备[25,28～31]。本文制备的染色体臂混合模板中包含数个至数百个BAC DNA,利用随机引物法和切口平移法制备的探针量较少,而DOP-PCR则使模板的扩增效率大大提高, 从而能够满足杂交的要求。在对混合BAC DNA模板进行DOP-PCR低严谨性扩增时, 本文首先对多个起始模板量(15 ng、50 ng、100 ng和200 ng)进行了优化, 结果表明, 当片段化之前的起始 DNA量大于等于 50 ng时, 各通道DNA探针的FISH信号强度并没有明显差别, 因此本文选取50 ng混合BAC DNA作为扩增模板的起始量。

为了确定上述方法制备探针的有效性, 还对食管癌细胞中的染色体畸变进行了检测和验证。利用本文制备的 2号和 16号染色体臂涂染探针, 在KYSE450中鉴定出了t(2q;16q), 与本实验室前期的M-FISH和array-CGH结果相吻合[13,16]。本研究发现, KYSE180中3p存在4个信号, 其中2个小信号位于t(2p;?;3p)衍生染色体上(图 3C), 而前期的 array-CGH结果表明, KYSE180中3p无拷贝数改变[16], 推测本文 FISH图中的小信号和大信号所示的区段之间可能存在一个断点, 不涉及拷贝数的增加或减少,表明来自于3p上的断点可能为平衡断点。

综上所述, 本研究建立的混合BAC DNA探针及其标记方法, 不仅可以广泛用于准确地鉴定实体肿瘤细胞中的染色体畸变, 为利用 M-FISH鉴定肿瘤细胞中的染色体畸变提供了相对准确的方法, 而且还可能进一步推广应用于恶性血液病的核型分析以及产前诊断。

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(责任编委: 史庆华)

Identification of chromosomal aberration in esophageal cancer cells by mixed BAC DNA probes of chromosome arms and regions

Jiajie Hao1, Chunli Wang1,2, Wenyue Gu1,3, Xiaoyu Cheng1, Yu Zhang1, Xin Xu1, Yan Cai1, Mingrong Wang1

1. State Key Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute (Hospital), Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China;
2. Department of Histology and Embryology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
3. Department of Pathology, Yancheng Third People’s Hospital, Yancheng 224001, China

Abstract:Chromosomal aberration is an important genetic feature of malignant tumor cells. This study aimed to clarify whether BAC DNA could be used to identify chromosome region and arm alterations. For each chromosome region, five to ten 1 Mb BAC DNA clones were selected to construct mixed BAC DNA clones for the particular region. All of the mixed clones from regions which could cover the whole chromosome arm were then mixed to construct mixed BAC DNA clones for the arms. Mixed BAC DNA probes of arms and regions were labeled by degenerate oligonucleotide primed PCR (DOP-PCR) and Nick translation techniques, respectively. The specificities of these probes were validated by fluorescence in situ hybridization (FISH) on the metaphase chromosomes of normal human peripheral blood lymphocytes. FISH with arm-specific mixed BAC DNA probes showed that chromosomal rearrangements and involved chromosome arms were confirmed in several esophageal cancer cells. By using region-specific mixed probes, the breakpoint on 1q from the derivative chromosome t(1q;7q) was identified in 1q32-q41 in esophageal KYSE140 cells. In conclusion, we established an effective labeling method for 1 Mb BAC DNA mixed clone probes, and chromosome arm and region rearrangements could be identified in several esophageal cancer cells by using these probes. Our study provides a more precise method for identification of chromosomal aberration by M-FISH, and the established method may also be applied to the karyotype analysis of hematological malignancies and prenatal diagnosis.

chromosomal aberration; BAC DNA; chromosome arms and regions; fluorescence in situ hybridization; esophageal cancer cells

2014-01-27;

2014-03-14

国家自然科学基金项目(编号：81201593, 81330052)和863计划重大专项(编号：2012AA02A503, 2012AA02A209)资助

郝佳洁, 博士, 助理研究员, 研究方向：肿瘤遗传学。E-mail: hjj8173@126.com

王明荣, 博士, 研究员, 研究方向：肿瘤遗传学。E-mail: wangmr2015@126.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0558

时间: 2014-5-5 8:54:33

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140505.0854.008.html