NKX2-5与先天性心脏病发病关系的研究进展

李金综述，唐燕华审校

NKX2-5与先天性心脏病发病关系的研究进展

李金综述，唐燕华审校

NKX2-5是最早被发现与心脏发育及成熟相关的转录因子，其异常的表达将影响胚胎心脏发育，最终可能导致心脏结构畸形和传导功能受损，甚至死亡。本文简要地回顾了NKX2-5的生物学特性及其在心脏发育中的作用，并汇总了近几年来在先天性心脏病（CHD）患者样本中新发现的NKX2-5 基因突变，为后继临床研究提供参考。

转录因子；先天性心脏病；心脏发育；基因突变

先天性心脏病（CHD）是指在胚胎发育时期心脏及大血管的形成障碍或发育异常，或出生后应自动关闭的通道未能闭合的一类常见先天畸形。流行病学资料显示，活产婴儿先天性心脏病发病率约为0. 5%～0.8%[1]，由于CHD 表现形式多，病因复杂，其具体的发病机制至今仍不明确。随着遗传学研究的深入开展及分子生物技术的广泛应用，人们对 CHD 的分子遗传学研究已取得了令人瞩目的成就，目前已有 NKX2-5、GATA4、TBX5、MYH6、ACTC1、 NOTCH1 等基因突变被证实与CHD的发生存在关联[2]。其中NKX2-5最早被发现与心脏的发育及成熟相关，是心脏发育过程中的重要转录因子之一。自1998年 Schott 等[3]首次在 CHD 患者中检测到NKX2-5基因的三个突变位点以来，在人群中开展 NKX2-5基因突变扫描已成为研究的热点。本文就转录因子 NKX2-5在心脏发育中的作用及近年来新发现的基因突变位点与单纯型 CHD 的关系进行阐述。

1 先天性心脏病简述

CHD 是人类出生缺陷中最常见的畸形，约有80%的患者仅表现为心脏畸形，而不伴有其他系统的先天异常，称之为单纯型 CHD。CHD 多为散发病例，也有少数呈家族性发病。根据 CHD 临床表现有无紫绀可分为紫绀型心脏病和非紫绀型 心脏病。紫绀型心脏病是因心脏和大血管结构异常而导致心内血液右向左分流的一类疾病，早期即可出现肺动脉高压，包括法乐四联症（TOF）、单心室（SV）、大动脉转位（TGV）等。而非紫绀型心脏病表型则更为复杂多样，临床上常见的类型有：房间隔缺损（ASD）、室间隔缺损（VSD）、动脉导管未闭（PDA）和房室传导阻滞（AVB）等。

2 NKX2.5 生物学特征

人类 NKX2-5基因在进化过程中高度保守，也常被称为CSX 基因或心脏特异性同源盒基因，其定位于染色体 5q35，具有两个外显子，互补脱氧核糖核酸（cDNA）全长1 585bp，可编码含有324个氨基酸的蛋白[4]。NKX2.5 蛋白分子量为35 kDa，含有三个高度保守的结构域，它们分别是 TN 结构域（氨基酸10-21）、同源结构域（氨基酸138-197）及 NK2-SD结构域（氨基酸212-234）[3，4]。其中同源结构域又称为 HD结构域，蛋白质三级结构表现为3个 a-螺旋，为可辨识螺旋，可特异结合于 DNA 顺式作用元件5’-T（C/T）AAGTG-3’（NKE）序列，从而启动下游基因的转录[5]。NK2-SD 结构域在体外基因实验中表现出转录活性的抑制作用，而关于 TN区域的作用目前尚不明确。以上信息提示 HD 结构域可能是NKX2-5发挥下游基因调控作用的核心部位。

3 NKX2-5 在心脏发育中的作用

心脏发育是一个极其复杂的过程。最初心脏起源于三胚层胚盘头端、口咽膜前方的脏壁中胚层（生心区），经历了心脏细胞特化、心管发生、心脏环化，最终发育形成具有心房、心室、间隔和瓣膜等结构的成熟心脏。这些结构的形成和正常发育均涉及胚胎发育过程中的不同时间和空间的若干个特定基因或基因组的先后精准表达[6]。

在心脏发育过程中，相关特定基因的正常表达是形成具有功能性心脏的关键，而 NKX2-5正是这些相关特定基因中最早表达产物之一，也是心脏前体细胞最早的标志物。NKX2-5作为转录因子调控网络的起始端，参与了心脏前体细胞的分化、心脏环化、房室分隔、房室流出道和传导系统的形成及成体心脏正常功能的维持，并持续表达于心肌细胞分化的各个阶段，在胚胎、胎儿乃至成体心肌细胞中均保持一定的表达水平[6]。

早在上世纪90年代，人们就从果蝇身上分离出与果蝇心脏发育密切相关的 tinman 基因（NK-2 型基因），并在以后的研究中证实其与 NKX2-5基因高度同源，它的突变会导致果蝇心脏形成异常。为进一步探讨 NKX2-5基因的表达与人类心脏发育的关系，研究者们在与人类基因组类似的小鼠模型中初见端倪。Ueyama 等[7]报道了 NKX2-5从小鼠胚胎发育的第 7.5天开始表达，NKX2-5基因缺失的小鼠心脏环化受阻，约在第 11天左右死亡。Terada 等[8]利用他莫昔芬诱导敲除胚胎发育第 12.5天的小鼠 NKX2-5基因，结果发现小鼠在第 16天时出现心律失常、结构异常等现象，于第 17.5天时死亡。这些现象提示无论在胚胎发育的早期还是中期，NKX2-5基因的缺失都可能使心脏发育停滞在相应阶段，甚至导致胚胎死亡。此外，Kasahara 等[9]NKX2-5基因过表达的研究中，也发现了小鼠于胚胎发育过程中出现房室传导阻滞和心脏结构缺陷等表型。综上可推测人类 NKX2-5基因表达的异常也可能对心脏正常形态、结构和传导系统等造成重要影响。

4 NKX2-5 基因突变与先天性心脏病的关系

NKX2-5作为目前研究与心脏发育相关最广泛的转录因子之一，其基因的测序和突变筛查备受研究者们关注。以往报道了40余种 NKX2-5基因突变位点可能与 CHD 的各种表型发生相关[4]。近年来，国内外学者在单纯型 CHD 患者的血样本或/和心肌组织样本中至少探测出28种突变类型[10-24]，它们大部分为新发现的基因突变位点，其中发生在 HD 结构域的有4种，有1种发生在 NK2-SD结构域。这些基因突变广泛分布于 NKX2-5基因编码区及非编码区的各个区域，包括错义突变、缺失突变、插入突变和同义突变等（见表1和表2）。从表中不难看出NKX2-5基因突变与 CHD 的发生缺乏“突变—表型”对应关系，即同一突变位点可有多种 CHD表型，而同一 CHD 表型又可对应多种突变位点。此外，由于地理环境不同，人种不同，NKX2-5基因突变位点的检出还存在明显地域和人种差异[21]。

错义突变是指编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后，变成编码另一种氨基酸的密码子，从而可使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变，甚至对蛋白质的功能造成一定影响。新发现的错义突变多在罕见的家族性 CHD 中被检出，只有少部分来自于临床常见的散发性 CHD 患者。2010年，Gioli-Pereira等[17]在1例散发性三尖瓣下移畸形的患者中发现了 C.124 G＞C 的变异，同时却意外地在其无 CHD 表型的父母的血样本中同样检测到了该突变。这提示用单基因突变解释散发性 CHD 的发病机理可能存在缺陷。2012年，Granados-Riveron 等[20]在另1例散发性 ASD 患者中检测到了NKX2-5基因与 MYH6 基因的联合突变，其中前一个突变来源于无 CHD表型的父亲，而后者则来源于无 CHD表型的母亲。根据以上现象可以推测多基因联合突变更应该用于阐明散发性单纯型 CHD 的发病机制，而单基因错义突变可能只增加 CHD 患病的易感性。

插入和缺失突变可导致核苷酸的总数发生变化，常在突变位点后产生新的读码框，编码与之前完全不同的多肽链。新发现的2个缺失突变和1个插入突变，均来自于家族性单纯型 ASD 患者，它们的出现使 NK2-SD 结构域氨基酸序列发生较大改变[16]，甚至导致 HD 结构域和 NK2-SD 结构域部分或完全缺失[12，18]。这暗示着插入和缺失突变对NKX2-5结构和功能的影响可能大于错义突变，且与家族性 CHD 的发生关系可能更为密切。

不同于错义突变，发生碱基替换而不引起编码氨基酸的改变则称为同义突变。传统观点认为同义突变因其未导致氨基酸一级结构改变，从而不引起蛋白质功能的变化，因此不会成为致病因素。然而随着研究的深入，人们发现同义突变可能通过影响 mRNA 的转录进程或蛋白质的构象来调节蛋白质的表达和功能[25]。就高频率出现于编码区的 c.63 A＞G 变异而言[10-13，21]，有学者在独立扩增实验中发现碱基替换虽未引起21位的谷氨酸发生改变，但却导致 mRNA 转录活性下降20%[12]，并且最新的 Meta 分析也证实了 c.63 A＞G 可能成为CHD 患病的危险因素[26]。另外，在 NKX2-5基因调控区、启动区等非编码区突变的研究中，学者们先后证实了部分增强子及启动子区域位点的突变也将对转录活性产生减低或增强的影响，从而导致 NKX2-5异常表达[23，24]，进一步引发下游基因调控网络的失衡，为CHD的发生机制提供另外一种可能的依据。

表1 NKX2-5基因编码区突变位点、氨基酸改变及先天性心脏病表型等对比

表2 NKX2-5基因非编码区位点突变及转录活性影响分析

5 结语与展望

总而言之，转录因子NKX2-5在胚胎心脏的发育过程中起到了举足轻重的作用，它的异常表达将对心脏结构和传导系统的发育造成重要影响。近年来，新检出的突变在一定程度上扩增了 NKX2-5基因突变在 CHD 相关研究中的种类，为阐明 NKX2-5基因突变与单纯性CHD的发病关系提供了更多的新思路。然而，遗憾的是新发现的突变大多未进一步行蛋白质表达和功能学分析，所以由这些突变所引发的氨基酸序列改变是否都能成为 CHD 患病的危险因素还缺乏有力证据。期待今后有更多的学者能参与到CHD患者 NKX2-5基因及其相关基因突变筛查的研究中，并同时能对新发现的或以往报道的突变行转录活性、蛋白质功能、转染等相关分析，以明确突变引发的后果。为今后阐明 CHD的发病机理、基因产前诊断和基因靶向治疗等提供新向导。

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2014-03-03）

（编辑：曹洪红）

330006，江西省南昌市，南昌大学第二附属医院 心胸外科

李金 硕士研究生 主要从事心脏各类疾病与基因突变相关性研究 Email:m15870005858@163.com 通讯作者：唐燕华

Email:tyh6565@163.com

R541

A

1000-3614（2014）12-1061-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.026