瑞舒伐他汀上调沉默信息调节因子2相关酶1/核转录因子-κB信号通路抑制阿霉素所致的心肌损伤的研究*

席振创，王志蕴

瑞舒伐他汀上调沉默信息调节因子2相关酶1/核转录因子-κB信号通路抑制阿霉素所致的心肌损伤的研究*

席振创，王志蕴

目的：探讨沉默信息调节因子2相关酶1/核转录因子-κB（Sirt1/NF-κB）信号通路在抗肿瘤药阿霉素诱导的心肌损伤中的作用及瑞舒伐他汀钙的干预效果。

阿霉素；信息调节因子2相关酶1信号通路；心肌毒性损伤；瑞舒伐他汀

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1029.)

阿霉素属蒽环类抗肿瘤抗生素，通过阻断拓扑异构酶Ⅱ连接断裂脱氧核糖核酸（DNA）的能力发挥抗肿瘤作用，对恶性淋巴瘤、白血病、乳腺癌等疾病疗效显著。但阿霉素明显的剂量依懒性心肌细胞毒性反应，使其剂量和疗程受到限制。心肌细胞线粒体内膜富含心磷脂是阿霉素致心脏毒性的主要靶点。研究发现，阿霉素与心磷脂具有高亲和性，可与心磷脂紧密结合，在心肌细胞内被线粒体还原酶类还原为半醌自由基，后者再与分子氧反应，产生大量活性氧自由基，损伤心肌及线粒体功能[1]。因此，长期阿霉素化疗的患者，需联合应用一种既预防阿霉素心肌损伤，又不影响其抗肿瘤活性的药物。瑞舒伐他汀是国际公认的强效新型调脂药，不仅能调血脂，还具有抗炎、抗氧化、逆转斑块负荷、改善内皮功能、抗凝等诸多调脂外效应。既往大规模临床研究证实，瑞舒伐他汀能通过抗炎、抗氧化应激机制保护缺血心肌再灌注损伤[2,3]，但能否通过抗氧化作用保护阿霉素所致心肌毒性损伤，国内鲜见报道。本实验通过建立阿霉素心肌损伤动物模型，旨在探讨瑞舒伐他汀对阿霉素所致心肌毒性损伤的保护作用及其可能机制。

1 材料和方法

实验材料：本研究于2014-04至2014-07纳入4～6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠30只，体重（18.2±3.3）g，购自山东大学医学院实验动物中心[动物合格证号：SCXK(鲁)20130004，SPF（无特定病原体动物）级]。主要药物和试剂：注射用盐酸多柔比星（浙江海正药业股份有限公司生产，批号：H33021980，规格：10 mg/瓶）；瑞舒伐他汀钙（英国阿斯利康制药有限公司生产，批号：H20060406，规格：10 mg/片，7片/盒），研磨后用生理盐水配置成悬液；PV9000免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）过氧化物酶显色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；兔抗小鼠沉默信息调节因子2相关酶1（Sirt1）单克隆抗体、核转录因子-κB（NF-κB）抗体均购自美国Immuno Way 公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒均购于南京建成科技有限公司，自动石蜡组织脱水机、包埋机及切片机（浙江金华科迪仪器设备有限公司制造），离心机型号5810R（德国Eppendorf公司）。

动物模型构建及分组：30只C57BL/6J小鼠予普通饲料适应性喂养2天后，随机分为三组：对照组、模型组和干预组，每组10只。干预组预先给予瑞舒伐他汀钙悬液10 mg/（kg.d）灌胃，每天1次，共12天；模型组和对照组则在相同时间点给予等量的生理盐水灌胃。第7天灌胃后2 h，干预组与模型组分别给予阿霉素（15 mg/kg）腹腔注射建立心肌损伤模型；对照组给予等量生理盐水腹腔注射。建模后三组小鼠继续同前方式喂养5天。

症状及体征观察：建模后，密切观察各组小鼠精神状况、饮食、皮毛及存活率变化。

标本采集及指标检测：第12天末次给药后24 h处死全部小鼠，立即取心脏，用冷磷酸盐缓冲液（PBS，137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，pH7.4)冲洗后取心室部分，4%多聚甲醛（0.1M PBS，4 g多聚甲醛，pH7.4）固定，经常规脱水，透明，石蜡包埋，切成5 μm的厚切片，供苏木精-伊红（HE）染色及免疫组化染色。

组织形态学观察：切片经常规HE染色处理后，光学显微镜下观察心肌组织病理学改变。

心肌组织匀浆超氧化歧化酶活力和丙二醛含量的检测：天平称取0.1 g心尖部组织，剪碎加入0.9%的冷生理盐水9 ml中用匀浆机制成10%组织匀浆，置入离心管1006×g（3000 r/min）离心10 min后轻取上清液，采用邻苯三酚自氧化法测定SOD活力；硫代巴比妥酸显色法测定MDA含量；具体步骤均参照试剂盒说明及有关文献[4,5]。

免疫组化法测定心肌沉默信息调节因子2相关酶1单克隆抗体、核转录因子-κB蛋白表达：石蜡切片于室温放置60 min后，经二甲苯脱蜡、不同浓度梯度乙醇水化处理，用PBS液冲洗2次，每次5 min；将切片放入0.01 M枸橼酸缓冲液微波炉沸腾热修复抗原10 min，PBS液冲洗3次，每次5 min；正常10%山羊血清室温湿盒封闭30 min，清除血清，滴加兔抗小鼠Sirt1单克隆抗体（或NF-κB抗体），4℃湿盒孵育过夜；次日移去一抗，PBS冲洗冲洗2次，每次10 min，滴加二抗工作液，室温孵育30 min，移去二抗，PBS冲洗2次，每次10 min；切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），室温孵育20 min，0.1 M PBS液冲洗3次，每次5 min；DAB显色液显色；苏木精-伊红复染1 min后，按常规石蜡切片制作方法脱水透明处理，中性树脂封片，显微镜下分别观察Sirt1、NF-κB阳性细胞数目及显色强度并进行评分及采图，计算各切片各个阳性细胞免疫组化评分。评分标准：A为阳性细胞数分级 0～1%=0、1～10%=1、10～50%=2、50～80%=3、80～100%=4；B为阳性细胞显色强度分级0（阴性）、1（弱阳性）、2（阳性）、3（强阳性）。免疫组化评分= A×B。

统计学处理：应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。数据以表示，组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

小鼠一般状况：对照组小鼠体毛光滑、活动自如、饮食及摄食情况良好；模型组小鼠竖毛、活动迟缓、摄食量减少、呼吸急促、体重较对照组下降，2只小鼠死亡；干预组小鼠一般状况好于模型组，小鼠摄食及饮水量尚可、体重较对照组减轻，未见小鼠死亡。

小鼠心肌组织病理学变化：光镜下观察发现，与对照组相比，模型组小鼠心肌病理变化明显，可见弥漫的心肌细胞肿胀变性，毛细血管扩张、周围淋巴细胞浸润，部分区域可见心肌纤维排列紊乱、甚至断裂，心肌间质水肿；干预组与模型组相比，心肌组织结构改变明显减轻，仅可见部分心肌间质增宽、心肌纤维紊乱，局部少许淋巴细胞浸润。图1

图1 光镜下各组小鼠心肌组织病理改变（×200）

心肌组织匀浆超氧化歧化酶活力、丙二醛含量组间比较：模型组匀浆MDA含量显著高于对照组（P＜0.05），SOD活力水平则低于对照组（P＜0.05）；与模型组比较，干预组小鼠心肌组织匀浆SOD活力水平增高（P＜0.05），MDA含量显著降低（P＜0.05），差异均有统计学意义。表1

表1 各组小鼠心肌组织丙二醛含量和超氧化物歧化酶活力水平比较

表1 各组小鼠心肌组织丙二醛含量和超氧化物歧化酶活力水平比较

注：与对照组比较*P＜0.05，与模型组比较△P＜0.05

组别 超氧化物歧化酶 (U/mg) 丙二醛(nmol/mg)对照组 124.11±9.18 8.40±0.23模型组 73.89±6.92* 11.59±0.35*干预组 92.35±5.61△ 9.31±0.55△

心肌沉默信息调节因子2相关酶1单克隆抗体、核转录因子-κB蛋白的表达： Sirt1蛋白主要在心肌细胞核内表达（棕黄色颗粒为阳性表达），胞质内微量表达；NF-κB蛋白在核内及胞浆均有表达（棕黄色颗粒为阳性表达）。心肌Sirt1蛋白阳性表达干预组[（4.90±1.19）%]较模型组[（2.00±0.93）%]和对照组[（3.40±1.35）%]显著升高（P＜0.05），差异有统计学意义。心肌NF-κB蛋白阳性表达模型组[（5.75±2.19）%]较对照组[（2.00±1.15）%]和干预组[（3.30±1.16）%]明显升高（P＜0.05），差异有统计学意义。图2，3

图2 免疫组化法检测小鼠心肌沉默信息调节因子2相关酶1表达（×400）

图3 免疫组化法检测小鼠心肌核转录因子-κB蛋白表达（×400）

3 讨论

心脏毒性为阿霉素的主要不良反应，且多呈累积性和剂量依赖性，临床表现为各种心电生理异常：全导联低电压、特异性ST改变、一过性心律失常或传导阻滞，最终发展为心肌病、充血性心力衰竭。阿霉素心肌损伤机制目前尚未完全阐明，研究多集中在氧自由基释放、线粒体损伤、钙超载、细胞凋亡等方面，其中以对线粒体损伤引起的氧化应激学说的研究最为广泛。资料表明，阿霉素易引起心肌损伤源于其心磷脂高亲和力[1,6]。心磷脂是心肌线粒体内膜的主要成分，阿霉素可通过与心磷脂紧密结合，进入心肌细胞内，经过一系列电子传递反应，释放大量活性氧（ROS），如超氧阴离子、超氧自由基等。这些活性氧成分可不同程度的氧化心肌细胞膜、线粒体膜等生物膜的多价不饱和脂肪酸，影响膜通透性及流动性，最终破坏心肌细胞及线粒体的结构和功能，即脂质过氧化作用[7]。MDA是生物膜脂质过氧化的最终代谢产物，它在心肌组织中的含量变化可间接反映体内氧自由基的含量及心肌氧化应激损伤程度。SOD是体内重要的超氧化物阴离子自由基天然清除剂，可清除过剩的活性氧保护细胞免受自由基损害，在损伤部位其含量明显降低。EI-Aziz等[8]证实 ，阿霉素可诱导心肌氧化应激损伤，导致心肌细胞MDA含量显著升高，SOD活力下降。本研究发现，经腹腔注射阿霉素（15 mg/kg）后的小鼠，饮食、行为及精神状态显著异常；镜下显示心肌细胞肿胀明显，周围淋巴细胞浸润、肌纤维排列紊乱，部分心肌可见核固缩等凋亡样改变；心肌组织MDA含量明显升高，SOD活力显著降低，提示阿霉素致小鼠心肌脂质过氧化加重、抗氧化能力降低，诱发心肌损伤。

瑞舒伐他汀是心血管疾病一级、二级预防治疗中唯一能逆转动脉粥样硬化斑块负荷的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，且调脂效果显著优于同类他汀药物[9]。它的调脂外多效性，特别是抗炎、抗氧化应激作用近年来备受关注。临床和实验证据均表明，服用瑞舒伐他汀能显著改善不同病因诱导的心肌损伤。刘科卫等[10]研究不同剂量瑞舒伐他汀干预对急性心肌梗死择期经皮冠状动脉介入治疗患者预后的影响，发现持续负荷剂量可明显改善微循环、减轻炎症因子等造成的心肌损伤。Dourado 等[11]通过建立Wistar大鼠心肌梗死模型，证实瑞舒伐他汀能显著抑制心肌坏死，减少心肌梗死面积。研究还发现，瑞舒伐他汀对自身免疫性心肌炎、阿霉素心肌病、糖尿病心肌病均有保护作用[12,13]，但其预防心肌损伤的具体机制并未阐明。因此，探究瑞舒伐他汀对心肌损伤保护的详尽分子机制成为近年研究热点。Sirt1是从酿酒酵母中首次发现的高度依赖NAD+的组蛋白去乙酰化酶，与细胞增殖、分化、能量代谢、衰老和凋亡密切相关。近期研究表明[14]，Sirt1/NF-κB通路在炎症和免疫介导的细胞损伤中发挥着重要作用，其可能机制为：Sirt1使炎症中心NF-κB的P65亚基第310位赖氨酸去乙酰化，进而抑制整个NF-κB活性，使依赖于NF-κB激活转录的炎症细胞因子释放受阻，减轻炎症反应程度。他汀类药物能通过上调Sirt1改善血管内皮衰老程度[15]，是否也可通过上调Sirt1表达，进而抑制NF-κB及其下游炎症相关因子的释放保护阿霉素心肌损伤，国内外研究甚少。

本实验选用瑞舒伐他汀干预阿霉素诱导的小鼠心肌损伤模型，探索心肌Sirt1、NF-κB蛋白表达变化规律，研究结果发现经瑞舒伐他汀预处理能明显减轻小鼠心肌病理形态变化（仅见部分毛细血管扩张、少许淋巴细胞浸润），降低阿霉素诱导的心肌组织匀浆MDA含量，提高SOD活力，提示瑞舒伐他汀能通过提高SOD酶活力水平清除心肌内过剩的氧自由基，削弱活性氧对心肌包膜的脂质过氧化作用，稳定细胞膜结构。同时，瑞舒伐他汀干预后，小鼠心肌Sirt1表达升高，NF-κB明显下降，表明他汀上调了Sirt1的表达，并可能通过进一步抑制NF-κB的活性，终止了下游炎症介质释放对心肌的炎性损伤。

综上所述，瑞舒伐他汀对阿霉素性心肌损伤具有预防和保护作用，其机制可能与瑞舒伐他汀上调Sirt1/NF-κB通路抑制炎症介质释放、抗氧化有关。因此，临床接受阿霉素化疗的肿瘤患者，特别是合并冠心病的老年患者，选择瑞舒伐他汀早期干预，具有重要的临床指导意义。

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Rosuvastatin Up-regulating the Expression of Sirt1/NF-κB Signal Pathway and Inhibiting Doxorubicin-induced Cardiotoxicity Injury in Experimental Mice

XI Zhen-chuang, WANG Zhi-yun.
The Sixth Department of Internal Medicine, Aff i liated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan (250000), Shandong, China

WANG Zhi-yun, Email: jiangjun567567@163.com

Objective: To investigate the effects of rosuvastatin for up-regulating the expression of Sirt1/NF-κB signal pathway and inhibiting doxorubicin (DOX)-induced cardiotoxicity injury in experimental mice.Methods: A total of 30 male C57 BL/6J mice at (4-6) weeks of age were randomly divided into 3 groups. Treatment group, the mice received intra-gastric rosuvastatin for 7 days, followed by intra-peritoneal injection of DOX 15mg/kg to induce the cardiotoxicity injury, and then received rosuvastatin for another 5 days. Model group, the mice received intra-peritoneal injection of DOX 15mg/kg to induce the cardiotoxicity injury, and then received intra-gastric normal saline for the same volume. Control group, the mice received intra-gastric normal saline for the same volume. n=10 in each group. The mice were killed at 12 days after treatment. The pathological change in myocardial tissue was observed by HE staining, the myocardial oxidative stress indexes of malonadehyde (MDA) level and super oxide dismutase (SOD) activity were measure by theoperating kits and the protein expression of Sirt1/NF-κB was examined by immunohistochemistry.Results: Compared with Control group, Model group had obviously increased levels of MDA, NF-κB and decreased SOD activity, Sirt1 level, all P＜0.05; the mice in Model group showed disordered myocardial structure with inf l ammatory cell inf i ltration. Compared with Model group, Treatment group had obviously decreased levels of MDA, NF-κB (while they were still higher than Control group), and increased SOD activity, Sirt1 level, all P＜0.05; the mice in Treatment group showed intact myocardial structure with much less edema and lymphocyte inf i ltration.Conclusion: Sirt1/NF-κB signal pathway was involved in DOX-induced cardiotoxicity injury in experimental mice, rosuvastatin could protect the injury via up-regulating the expression of Sirt1/NF-κB signal pathway.

Doxorubicin; Sirt1signal pathway; Cardiotoxicity injury; Rosuvastatin

2014-09-13）

（编辑：许菁）

山东省自然科学基金面上项目（ZR2010HM084）

250000 山东省济南市，山东省医学科学院附属医院 济南大学山东省医学科学院 医学与生命科学学院

席振创 硕士研究生 主要从事心血管病基础与临床研究 Email：374338918@qq.com 通讯作者：王志蕴 Email：jiangjun567567@163.com

R54

A

1000-3614（2014）12-1029-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.017

方法：将30只4～6周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组和干预组，每组各10只。干预组预先给予瑞舒伐他汀钙稀释灌胃7天后，干预组和模型组分别给予阿霉素15 mg/kg腹腔注射建立心肌损伤模型，建模后干预组继续瑞舒伐他汀干预5天，同时模型组与对照组给予等量生理盐水灌胃。12天后，处死全部小鼠取心脏组织，多聚甲醛固定，经石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色后，观察各组小鼠心肌病理变化；取心肌组织匀浆检测氧化应激指标丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力；免疫组化法测各组小鼠心肌Sirt1/NF-κB表达水平。

结果：与对照组相比，模型组心肌匀浆MDA含量、心肌组织NF-κB水平均明显升高，匀浆SOD活力、心肌组织Sirt1水平均显著降低（P＜0.05），差异均有统计学意义，且心肌结构紊乱、炎症细胞浸润明显；与模型组比较，干预组MDA含量、NF-κB水平均明显下降但仍高于对照组，匀浆SOD活力、心肌Sirt1水平均升高（P＜0.05），差异有统计学意义，且心肌结构完整、细胞水肿及淋巴浸润明显减少。

结论：Sirt1/NF-κB信号通路参与了阿霉素诱导的心肌损伤过程，瑞舒伐他汀能通过上调该信号通路保护阿霉素所致的心肌毒性损伤。