人结肠癌细胞中CacyBP/SIP核转位差异表达基因的验证*

王安萍 赵盈盈 刘 欣 翟惠虹

钙周期素结合蛋白（CacyBP/SIP）是一种可以和钙周期素（S100A6）结合大小约30 ku的蛋白质。在结肠癌细胞中CacyBP/SIP主要定位于细胞质中，研究发现胃泌素、KCl[1]等作为刺激因子及缺氧[2]状态可使CacyBP/SIP核转位。为筛选出CacyBP/SIP核转位下游差异表达基因，本课题组在前期工作中成功构建了hCacyBP/SIP基因的胞核定位载体[3]，并将载体成功包装入慢病毒，取病毒上清和阴性对照上清感染人源性结肠癌SW480细胞，完成细胞周期聚合酶链反应（PCR）芯片，共筛选出88个差异表达基因。为排除人为导致胞核中CacyBP/SIP过表达筛选出差异表达基因的假阳性，同时明确在生理条件下CacyBP/SIP发生核转位后是否有相同差异表达基因，本研究选取差异表达倍数大于2的基因周期素依赖性蛋白激酶8（cyclin dependent kinase 8，CDK8）和细胞周期蛋白依赖性激酶亚基2（cyclin depen⁃dent kinase subunit 2，CKS2），并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术进行验证。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人源性结直肠腺癌细胞SW480购自北京协和细胞库；RPMI-1640培养液为Hyclon公司，胎牛血清、0.25%胰酶购自Gibco公司，胞浆、胞核蛋白抽提试剂盒及BCA蛋白定量试剂盒为南京凯基公司，胃泌素购自Abcam公司，CacyBP/SIP兔抗人单抗购自CST公司，PCNA鼠抗人单克隆抗体购自Abbkine公司，β-actin鼠抗人单抗、辣根酶标记羊抗兔/鼠IgG购自北京中杉。Trizol购自Invitrogen公司，cDNA反转录试剂盒为MBI公司产品，荧光定量PCR试剂盒购自promega公司，引物序列由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人结直肠腺癌细胞SW480在37℃、5% CO2、10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，待细胞生长状态良好，更换为无血清培养液培养24 h后，对照组SW480细胞继续无血清培养液培养，实验组细胞更换胃泌素浓度为1×10-7mol/L的无血清、无双抗培养液分别培养24、48 h。

1.2.2 免疫蛋白印迹（Western blot）检测胃泌素刺激前后CacyBP/SIP在细胞内的定位和表达 弃去培养液按试剂盒说明分别提取实验组和对照组细胞胞浆、胞核蛋白，BCA法蛋白定量。10%分离胶，110 V电压电泳120 min。半干转膜，5%脱脂奶粉封闭2～4 h，孵育一抗anti-CacyBP/SIP（1∶600），4℃过夜，二抗HRP标记羊抗兔（1∶5 000），洗膜，曝光。胞浆蛋白内参β-actin（1∶400），胞核蛋白内参PCNA（1∶1 000)。

1.2.3 细胞总RNA提取、反转录 Triozl法分别提取实验组胃泌素作用48 h的SW480细胞和对照组SW480细胞总RNA，检测光密度（OD）值在1.8～2.1之间的RNA,按照反转录试剂盒说明反转录成cDNA。

1.2.4 qRT-PCR检测胃泌素刺激前后CDK8、CKS2基因表达水平 cDNA模板2 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），2×Go Taq®Master PCR Mix 10 μL，无酶水补充为总体积至20 μL反应体系；反应条件：预变性95℃2 min;扩增反应95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s。检测荧光，共55个循环。平行重复实验3次。扩增反应引物序列见表1。反应结束后得到每个目的基因和管家基因β-actin的Ct值，用目的基因和管家基因Ct值差值进行统计学分析；用2-△△Ct法计算实验组和对照组基因差异表达倍数。

Table 1 The PCR primer and the Tm of genes表1 PCR扩增反上下引物序列及Tm值

1.3 统计学方法 用SSPS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，2组间均数比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃泌素刺激前后CacyBP/SIP在细胞内的定位和表达 选胃泌素作为刺激因子，诱导CacyBP/SIP发生核转位。无胃泌素刺激时CacyBP/SIP主要在细胞质中表达，胞核中仅少量表达。给予1×10-7mol/L胃泌素分别刺激24、48 h后，可同时在细胞质和细胞核中检测到CacyBP/SIP的表达，见图1。且胃泌素作用48 h的效果较24 h明显，说明胃泌素成功诱导CacyBP/SIP入核。

Figure 1 The expression of CacyBP/SIP in cytoplasm and nuclear detected by Western blot assay before and after stimulation图1 Western blot检测胃泌素刺激前后CacyBP/SIP在胞质及胞核中的定位

2.2 qRT-PCR结果 在CacyBP/SIP核转位前后，基因CDK8和CKS2在细胞SW480中的变化差异方向同芯片结果一致，CDK8和CKS2两目的基因均表达上调，见图2、3。且实验组和对照组中两基因表达差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。其中基因CDK8的倍数变化为2.38，基因CKS2的倍数变化为2.25。

Figure 2 The amplification curves of real-time quantitative PCR图2 qRT-PCR扩增曲线

Figure 3 The dissociation curves of real-time quantitative PCR图3 qRT-PCR溶解曲线

Table 2 Comparison of expression changes of CDK8 and CKS2 genes before and afterstimulation表2 胃泌素刺激前后基因CDK8、CKS2表达变化比较（△Ct,±s）

Table 2 Comparison of expression changes of CDK8 and CKS2 genes before and afterstimulation表2 胃泌素刺激前后基因CDK8、CKS2表达变化比较（△Ct,±s）

＊P＜0.05

组别实验组对照组t n33 CDK8 10.35±0.37 11.60±0.59 3.129＊CKS2 4.59±0.43 5.76±0.51 3.053＊

3 讨论

3.1 胃泌素诱导CacyBP/SIP核转位使得基因CDK8和CKS2发生差异表达 翟惠虹等[1]发现在结肠癌细胞中胃泌素可刺激主要表达在细胞质中的CacyBP/SIP蛋白发生核转位，这种核转位具有Ca2+浓度依赖现象，同时伴有蛋白磷酸化现象。蛋白在细胞中表达定位与其生物学功能密切相关，CacyBP/SIP在胃泌素刺激下发生核转位和磷酸化，提示其可能作为信号分子传递信息从而参与细胞功能的调节。为明确在生理条件下CacyBP/SIP核转位是否会有相同差异表达基因，本研究选择用胃泌素作为刺激因子，诱导CacyBP/SIP入核,结果显示胃泌素诱导 Ca⁃cyBP/SIP入核后基因CDK8、CKS2表达上调，这与PCR芯片结果一致,说明在胞核中CacyBP/SIP过表达情况下筛选出差异基因表达趋势同胃泌素诱导CacyBP/SIP核转位后结果一致。

3.2 CDK8和结肠癌的关系 Firestein等[4]研究发现在人类结肠癌细胞中CDK8转录水平对细胞周期和细胞生长的调控发挥重要作用，因而被提议为早期致癌基因。Firestein等[5]还发现CDK8参与由βcatenin介导的原癌基因激活。He等[6]发现在结肠癌细胞中，CDK8表达量降低后通过降低β-catenin表达及阻滞细胞G0/G1期的转换，进而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。这表明CDK8通过影响β-catenin的表达量进而调节结肠癌细胞生物学活动。

3.3 CKS2与结肠癌的关系 基因CKS2是CKS家族成员之一，可催化亚基结合形成复合物。过表达的CKS2在细胞应激情况下阻断DNA复制的S期内检查点，使DNA持续性复制进而调控细胞周期进程[7]。CKS2在细胞减数分裂过程中具有非常重要的作用，是生殖细胞从减数第1次分裂中期到后期的必要条件[8]。研究发现在膀胱癌[9]、食管癌[10]、胃癌[11]、胆管癌[12]等恶性肿瘤中CKS2均呈高表达，且与肿瘤的侵袭性和预后不良密切相关，进而有望成为一种新的肿瘤生物学标志物。与正常组织、癌旁组织相比较，CKS2在结肠癌中也呈现高表达[13]。

3.4 CacyBP/SIP与肿瘤的发生发展关系 在不同肿瘤细胞中CacyBP/SIP发挥不同的生物学作用，在肾癌细胞中其可能通过降低β-catenin表达量使CyclinD1蛋白表达下调，进而阻碍细胞周期的进展[14]；在胰腺癌细胞中其通过促进细胞周期G1/S期的转换进而促进胰腺癌细胞增殖[15]；在胃癌细胞中CacyBP/SIP可通过对β-catenin表达和T细胞因子/淋巴增强因子（Tcf/LEF）转录激活的影响进而抑制胃癌细胞的增殖[16]。以上研究表明CacyBP/SIP在肿瘤细胞中大多数是通过对细胞周期调控及β-catenin活动调节而参与肿瘤细胞生物学活动的。

综上，本研究发现胃泌素可刺激CacyBP/SIP发生核转位；同时也证明在CacyBP/SIP过表达情况下完成的细胞周期PCR芯片所筛选出来的差异表达基因同生理条件下CacyBP/SIP核转位后的差异表达基因一致，对筛选出来的差异表达基因与CacyBP/SIP的关系值得进一步研究。

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