miRNA-1对大鼠心肌细胞凋亡的影响

王霁翔 丛洪良

微小RNA（MicroRNA，miRNA）是高度保守的内源性单链非编码RNA，长度为18～25个核苷酸。它们以不完全互补的方式与成熟mRNA结合，抑制mRNA的翻译或使mRNA降解，在转录后水平调节蛋白质的表达。近年来发现，miRNA与心血管系统疾病有非常密切的关系，心脏疾病伴随着miRNA表达谱的变化；改变细胞内或细胞外的miRNA表达可以引起心肌梗死、肥大或心律失常等心脏疾病[1-2]。其中，miRNA-1被认为具有心肌特异性，与心肌细胞的病理改变密切相关[3-4]。本实验旨在通过研究miRNA-1水平与凋亡调控基因Bcl-2表达变化的关系，探讨miRNA-1在心肌细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 大鼠H9c2心肌细胞株购自中科院上海细胞库。DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（美国Gibco公司），转染试剂Lipofectamine 2000、RNA提取试剂Trizol、逆转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂、real-time PCR试剂盒（美国Invitrogen公司），miRNA-1 mimics和miRNA阴性对照片段由上海吉玛公司设计并合成，Bcl-2抗体（ABCAM公司），β-actin抗体（Proteintech公司），FITC Annexin V凋亡试剂盒（美国BD公司）。ABI 7500型实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 细胞培养和转染 大鼠H9c2心肌细胞株在含有10% FBS的高糖DMEM培养基中，于37℃、5%CO2的孵箱中培养。平均每3 d传代1次。当细胞生长密度达到约70%融合时，换液备用。24 h后将细胞分为3组。空白对照组：常规条件培养的H9c2细胞；阴性对照组：根据转染试剂Lipo⁃fectamine 2000的操作说明，转染随机合成的miRNA阴性对照片段；miRNA-1组：转染miRNA-1 mimics片段的H9c2细胞。将溶于无血清DMEM中的miRNA-1 mimics与Lipo⁃fectamine 2000轻轻混合后室温孵育20 min，然后将此混合物加入到细胞培养液中，放入培养箱中继续培养48 h。

1.3 real-time PCR检测细胞miRNA-1水平 按照RNA提取试剂Trizol的说明书进行操作，提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测总RNA的浓度和纯度，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。逆转录合成cDNA后进行real-time PCR检测，以U6作内参。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃10 s，60℃30 s，40个循环。目的基因的相对表达量根据公式2-△Ct计算得到（△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因）。

1.4 细胞生存率检测 转染前1 d，将对数生长期的细胞接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，24 h后分别转染miRNA-1 mimics和miRNA阴性对照片段，以不进行转染处理的细胞作为空白对照，以只加培养液的孔作为调零孔。48 h后，向96孔板中的各组细胞中加入5 g/L的噻唑蓝（MTT）20 μL，于37℃、5%CO2培养箱中孵育4 h。吸净各孔液体，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，室温下置于水平摇床上至结晶完全溶解。用酶标仪检测溶解液在490 nm波长处测定各孔的吸光度（A）值。以空白对照组的细胞生存率为100%，实验组细胞生存率（%）=实验组A值/空白对照组A值×100%。

1.5 流式细胞仪双染法检测细胞凋亡率 将处于对数生长期的细胞按照1×105/孔的密度接种于6孔板中，培养24 h后按照上述分组情况给予相应处理并继续培养48 h。胰酶消化收集各组细胞，PBS洗涤2次，用binding buffer重悬细胞并调整细胞浓度至1×106/mL，将细胞转移至流式专用管中，加入荧光标记的AnnexinV和PI试剂各5 μL，室温下避光孵育15 min，进行流式细胞仪检测。

1.6 定量PCR和Western Blot检测Bcl-2 mRNA和蛋白表达 按照1.3所述方法和公式提取细胞总RNA和计算目的基因Bcl-2的相对表达量。目的基因为Bcl-2，扩增长度为120 bp，内参基因为β-actin，扩增长度为105 bp。PCR条件：95℃预变性5 min；94℃15 s，退火60℃45 s，循环40次。

提取细胞总蛋白，BCA法定量。用蛋白溶解液调整蛋白浓度为5 g/L，取40 μg总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），切取包含Bcl-2（25 ku）或β-actin（42 ku）的凝胶进行转膜后，用5%脱脂奶粉封闭NC膜2 h，加一抗Bcl-2（1∶500）或β-actin（1∶1 000），4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次2 mL，洗涤5 min。加入二抗（1∶500）常温孵育2 h。弃掉二抗，再次TBST洗膜3次，加入1 mL ECL发光液与膜充分接触，于成像系统进行图像采集。Bcl-2蛋白的相对表达量为Bcl-2蛋白条带与内参β-actin蛋白条带吸光度值的比值。

1.7 统计学方法 应用SPSS 11.5软件进行统计学分析，计量资料均以±s表示，多组间均值比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中miRNA-1的水平 3组miRNA-1水平比较差异有统计学意义（F=13.73，P＜0.05）。miRNA-1组的miRNA-1相对表达量为3.46±1.28，明显高于空白对照组的0.66±0.14和阴性对照组0.71±0.16（均P＜0.01）。

2.2 MTT法检测细胞生存率 3组间细胞生存率比较差异有统计学意义（F=69.60，P＜0.05）。miRNA-1组细胞生存率为45.69%±8.13%，明显低于阴性对照组的97.87%±10.21%和空白对照组的100%± 8.61%（P＜0.01）。

2.3 流式细胞仪双染法检测细胞凋亡 转染miR⁃NA-1 mimics 48 h后，细胞凋亡率为15.7%±2.82%，明显高于空白对照组（3.13%±0.45%）和阴性对照组（3.33%±0.70%），差异有统计学意义（F=54.06，P＜0.01），见图1。

Figure 1 The result of apoptosis rate detected by FCM图1 流式细胞仪双染法检测细胞凋亡率

2.4 定量PCR和Western Blot检测Bcl-2 mRNA和蛋白表达结果 转染miRNA-1 mimics 48 h后，大鼠心肌细胞凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA表达水平（1.45±0.08）明显低于空白对照组（2.38±0.13）和阴性对照组（2.39±0.15），差异有统计学意义（F=57.80，P＜0.01）。而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义。Bcl-2的蛋白表达水平：空白对照组（0.95±0.05）和阴性对照组（0.94±0.11）比较差异无统计学意义，miRNA-1组（0.50±0.10）明显低于空白对照组和阴性对照组（F=23.76，P＜0.01），见图2。

Figure 2 The expression levels of Bcl-2 protein in different groups图2 各组Bcl-2蛋白表达情况

3 讨论

miRNA在细胞发育的所有进程中起关键性作用，参与调节细胞的增殖、分化、衰老、死亡以及维持细胞的自我更新[5-6]。miRNA-1是近年来研究较多的与心脏疾病有关的microRNA[7-8]，包括miRNA-1-1和miRNA-1-2两个成员，其基因长度均为21 bp。miRNA-1只在心肌和骨骼肌中表达，被认为具有肌细胞特异性，其表达受到转录因子如血清反应因子、肌细胞增强因子-2（Mef2）或MyoD和肌肉调节因子（MRFs）等的调节。miRNA-1与心肌细胞的病理状态密切相关。Yang等[3]研究发现，冠脉疾病患者的心肌组织中miRNA-1水平升高，其通过抑制K+通道Kir2.1亚基的编码基因KCNJ2和缝隙连接蛋白Cx43的编码基因GJA1转录后水平使细胞膜去极化、传导力降低，从而引起或加重心律失常的发生。Shan等[4]报道，缺血大鼠心肌组织高表达miRNA-1，caspase-3活性和线粒体膜电位均升高，细胞凋亡明显，并通过实验证实miRNA-1通过降低胰岛素样生长因子（IGF）的蛋白表达水平促进了心肌细胞的凋亡，引起了上述变化。

miRNA-1的靶基因多数为与细胞凋亡和增殖有关的基因，如PTMA[9]、PNP[10-11]等。Bcl-2是一种原癌基因，是阻遏细胞凋亡的核心分子，可以维持线粒体跨膜电位，抑制线粒体细胞色素C的释放，从而抑制下游caspase的激活，发挥抗凋亡作用。本研究结果表明，向心肌细胞内导入miRNA-1片段使心肌细胞高表达miRNA-1后，心肌细胞凋亡率升高，Bcl-2的表达水平降低。miRNA-1不仅作用于Bcl-2的转录后水平，也抑制了Bcl-2的转录水平，通过降低Bcl-2的mRNA和蛋白表达促进了心肌细胞的凋亡。

已有研究报道，拮抗一个miRNA有望纠正心力衰竭时的不良信号转导途径，具有成为预防和治疗靶标的潜能[12]。本研究进一步阐明了miRNA-1在心肌细胞凋亡中的作用，为miRNA-1的临床应用提供了实验依据。

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