成人隐匿性自身免疫性糖尿病早期血浆SERPING1的变化及意义*

秦 雯 张佳俐 夏 宁△

成人隐匿性自身免疫性糖尿病（latent autoim⁃mune diabetes in adult,LADA）以与糖尿病相关的自身抗体阳性为特征[1]。LADA患者胰腺β细胞自身免疫性破坏发生的速度较慢，使其早期血糖的增高有一个潜伏期。尽管LADA在发病初期与2型糖尿病（T2DM）很相似[2-3]，但就治疗方法而言两者应当有所区别[4-5]。因此，早期诊断LADA有重要的临床价值。最近，有蛋白组学研究发现血浆C1酯酶抑制物（plasma protease C1 inhibitor,SERPING1）可能成为1型糖尿病（T1DM）的新的血浆标志物[6]。和T1DM一样同属自身免疫性糖尿病的LADA，其患者血浆中SERPING1的表达是否也有同样趋势尚鲜见报道。本研究旨在评价SERPING1与LADA的关系，进而探讨SERPING1水平变化对LADA的早期预测价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2011年8月—12月在我院内分泌门诊就诊的LADA患者58例，T1DM患者52例，T2DM患者65例纳入本研究。上述糖尿病患者均符合2003年美国糖尿病协会（ADA）诊断标准，并且均为病程在6个月之内的早期患者。排除标准：（1）线粒体基因突变糖尿病患者。（2）青少年起病的成人型糖尿病患者。（3）其他原因所致糖尿病和妊娠期糖尿病患者。（4）其他自身免疫疾病患者。另选同期条件相匹配的健康志愿者83例为正常对照（NC）组。所有258例参与研究者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 受试者过夜禁食12 h，次日清晨空腹采肘正中静脉血检测空腹C肽（FCP）、空腹血糖（FPG）及糖化血红蛋白（HbA1c）水平；继而行馒头餐试验（食用100 g标准面粉制成的馒头），5 min内食用完，从开始进食第一口馒头起算时间，于进食馒头餐2 h后取血检测餐后2 h血糖（2 hPG）、餐后2 h C肽（2 hCP）水平。另留取部分空腹血标本以4℃恒温离心机3 000 r/min离心10 min，分离血浆于-80℃冰箱保存，统一检测谷氨酸脱羧酶抗体（glutamic acid decarboxylase, GADA）及SERPING1水平。

1.2.2 一般实验室指标检测 HbA1c采用高效液相法，美国Bio-Rad公司D-10全自动糖化血红蛋白仪测定；FPG、2 hPG采用葡萄糖氧化酶法，西门子公司ADVIA2400全自动生化仪测定；FCP、2 hCP采用化学发光法，美国DPC公司全自动化学发光免疫分析仪（IMMULATE-1000）测定；GADA使用北京北方生物技术研究所生产的酶联免疫吸附测定（ELISA）诊断试剂盒自行集中测定（该试剂盒的结果判定标准为：Cutoff值=阴性对照平均光密度（OD）值×2.1；样本OD值≥Cutoff值为阳性，＜Cutoff值为阴性）。

1.2.3 SERPING1检测 使用武汉华美生物工程公司生产的人类SERPING1蛋白竞争法ELISA测量试剂盒，并在终止反应后15 min内、在450 nm波长下读取OD值，各个复孔取平均值。运用回归分析做拟合标准曲线，根据稀释倍数计算出各样品的实际浓度。

1.3 统计学方法 所有数据均采用SPSS 16.0软件包进行统计学分析。计量资料行正态性和方差齐性检验，再进行统计学分析，正态分布者采用（±s）表示，多组间样本均数比较用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。偏态分布计量资料用中位数（M）表示，采用多个独立样本Kruskal-wal⁃lis秩和检验，统计量为χ2，组间多重比较采用数据编秩转换后SNK-q检验。计数资料采用χ2检验。血浆SERPING1与其他指标的相关性采用Spearman相关分析。回归分析采用多元逐步线性回归分析法。采用受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析SERPING1早期预测LADA的诊断效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料的比较 各组性别构成、病程比较差异无统计学意义。LADA组年龄高于T1DM组（P＜0.05），而与其他各组比较差异均无统计学意义。LADA组与T1DM组、T2DM组、NC组的HbA1c、FPG、2 hPG、FCP、2 hCP指标间差异部分有统计学意义（P＜0.05），见表1。GADA作为糖尿病分型指标纳入检测，但组间比较因为LADA组、T1DM组GA⁃DA阴性为0，而T2MD组、正常组阳性为0，不宜行统计学分析，待以后数据资料增加后再行统计学分析。

Table 1 Baseline characteristics in four groups表1 各组一般资料的基线水平 （±s）

Table 1 Baseline characteristics in four groups表1 各组一般资料的基线水平 （±s）

表中数据描述方式为例或±s或M；＊＊P＜0.01；a与LADA组比较，P＜0.05

组别LADA组T1DM组T2DM组NC组F或χ2 n 58 52 65 83性别（男/女）32/26 28/24 37/28 48/35 0.245年龄（岁）37.2±5.1 12.2±3.8a 38.2±4.7 36.8±4.7 413.435＊＊病程（月）4.8±1.1 4.5±1.2 4.7±1.2 -0.819 HbA1c（%）8.2±0.8 8.6±0.8a 7.8±0.7a 5.1±0.4a 416.729＊＊组别LADA组T1DM组T2DM组NC组F或χ2 n 58 52 65 83 FPG（mmol/L）9.2±1.7 10.0±1.6a 9.0±1.2 5.1±0.7a 210.807＊＊2 hPG（mmol/L）15.8±1.5 17.0±1.9a 13.8±0.8a 6.1±1.1a 985.843＊＊FCP（μg/L）0.705 0.530a 1.87a 1.48a 204.547＊＊2 hCP（μg/L）1.3±0.2 1.0±0.2a 6.0±1.5a 5.6±1.9a 262.050＊＊GADA（+/-）58/0 52/0 0/65 0/83 -

2.2 各组SERPING1水平比较 LADA组、T1DM组、T2DM组、NC组血浆SERPING1（mg/L）分别为325.00±72.70、337.26±86.70、296.45±71.20、292.04± 58.46，4组间差异有统计学意义（F=5.991，P＜0.01），LADA组高于T2DM组、NC组（P＜0.05），而与T1DM组比较差异无统计学意义。

2.3 LADA组SERPING1与其他指标的关系 在LADA组SERPING1水平与FCP呈负相关（rs=-0.680），与HbA1c、FPG、2 hPG呈正相关（rs分别为0.550、0.547和0.476，均P＜0.05）。以血浆SERPING1为因变量，年龄、病程、FPG、2 hPG、HbA1c、FCP、2 hCP为自变量，行多元逐步线性回归分析，因为LADA组样本量较小，根据临床经验将年龄、病程、FPG、2 hPG、HbA1c、FCP、2 hCP作为自变量，逐个纳入行多元逐步回归分析，纳入检验水准P＜0.1，排除标准P＞0.1所得结果，初步排除年龄和2 hCP。最终将其余5个指标作为自变量，行多元线性回归分析，结果FCP进入回归方程（P＜0.001）,见表2。

Table 2 The multiple regression analysis of SERPING1 and related factors in patients with LADA表2影响LADA患者SERPING1相关因素的多元回归分析

2.4 血浆SERPING1对LADA的早期预测 采用ROC曲线分析SERPING1早期鉴别LADA和T2DM患者的效能，见图1。ROC曲线下面积（AUC）为0.613，与完全随机获得的面积0.50间差异有统计学意义（P＜0.05），95%CI为0.514～0.712。SERPING1早期预测LADA的最佳临界值为289.71 mg/L，灵敏度69%，特异度48%。

Figure 1 ROC curves of SERPING1图1SERPING1的ROC曲线

3 讨论

LADA的早期诊断一直是临床上比较困难的问题，目前自身抗体检测阳性是其最直接的依据。但是自身抗体的种类很多，若一一进行筛查成本太高；此外，自身抗体的产生需要一定的时间（特别是IgG抗体）；而且随着病程的延长，有的抗体会逐渐减弱[7]；再加上许多尚未被医学界发现和识别的自身抗体，可能导致结果出现假阴性；这些都不利于LADA的早期诊断。

SERPING1本质上是一种105 ku的分泌蛋白。它既是丝氨酸蛋白酶抑制剂，能高效地抑制糜蛋白酶和激肽释放酶，也是体内主要的抗炎蛋白[8]。它能通过和C1r或者C1s蛋白酶结合形成低活性的化合物而控制C1复合体的激活[9]，可能在调节一些重要的生理学路径方面扮演重要的角色。这些路径包括补体激活、血液凝固、纤维蛋白溶解和产生激肽等。SERPING1主要参与如下的生理功能：血液循环、血液凝固的内源性途径、补体激活的经典途径、纤维蛋白溶解、先天免疫应答[10]、补体激活和外源性凝集素的负调控、血小板的激活和脱颗粒。有研究显示某些与炎症和微血管相关的基因在糖尿病幼鼠模型中是上调的，其中就包括SERPING1[11]。Zhang等[6]运用LC-MS蛋白组学策略对经典T1DM、T2DM和正常人进行对照研究，发现在经典T1DM中血清蛋白组学表现出系统性的先天免疫调节异常，并发现SERP⁃ING1是区分经典T1DM和T2DM的指标，它在经典T1DM中是上调的。

本研究显示，LADA组血浆SERPING1高于T2DM组和正常对照组。由于LADA与T1DM有着相似的发病机制，所以可以认为本研究结果与上述研究结果有一致性。进一步通过相关分析及多元逐步回归分析发现，SERPING1与FCP呈负相关，FCP是血浆SERPING1的主要影响因素。而FCP又是体现胰岛功能是否损害的指标，这就表明SERPING1对早期预测LADA有提示作用，故可采用ROC曲线评价SERPING1值对早期LADA患者的检出效能。ROC曲线是国际公认的评价诊断效能的客观指标，而0.5＜AUC≤0.7表示诊断价值一般。本研究通过ROC曲线分析证明，SERPING1预测LADA的曲线下面积恰在此范围内，所以单独依靠SERPING1早期预测LADA的精准性存在一定缺陷，而SERPING1联合其他指标检测将大大提高其诊断效能。虽然ROC曲线表明SERPING1对LADA的早期预测价值一般，但是通过各组间SERPING1的比较、SERPING1与LADA组中其他资料及指标的相关分析，均提示其与LADA关系密切，SERPING1可能参与到LADA的早期发病过程。目前有研究证实[8,11]，由于SERP⁃ING1是连接及补体系统中主要的蛋白酶抑制剂，因此它也是一种有效的抗炎蛋白，并可能成为一种针对多种炎症性疾病（包括自身炎症性疾病）的治疗蛋白；而这些炎症性疾病中已被研究证实的有败血症、心肌梗死、遗传性血管性水肿等[12-13]。LADA也是与炎症反应密切相关的一种自身免疫性疾病，能否以SERPING1参与LADA的发病机制为切入点，探索治疗LADA的新途径是今后研究的一个思路。

本研究存在一定的局限性：首先，本研究的样本量稍小，缺乏多中心研究。其次，由于在已知的LA⁃DA自身免疫性抗体中，GADA在患者中的阳性率较高，所以本研究只收集了GADA阳性的LADA患者的血浆标本，今后将加入其他自身免疫性抗体阳性的LADA标本、进一步扩大样本量进行多中心的深入研究。总之，基于以上的研究背景与临床研究结果，可以初步认为虽然SERPING1可在一定程度上预测LADA的发生，但仍需综合临床和其他实验室检查才能作出准确判断；SERPING1对LADA的发病机制和治疗有一定的提示作用，不过还有待更深入的研究确认。

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