OGR1籍ERK信号通路参与酸性微环境致气道上皮细胞黏蛋白5AC表达

周万，周向东，尤列·皮尔曼，维克多·科罗索夫

（1.重庆医科大学附属第二医院呼吸内科，重庆400010；2.俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理中心，布拉戈维申斯克675000）

OGR1籍ERK信号通路参与酸性微环境致气道上皮细胞黏蛋白5AC表达

周万1，周向东1，尤列·皮尔曼2，维克多·科罗索夫2

（1.重庆医科大学附属第二医院呼吸内科，重庆400010；2.俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理中心，布拉戈维申斯克675000）

目的探讨气道酸性微环境诱导气道上皮细胞黏蛋白5AC表达的上游信号通路调节机制。方法体外培养人气道上皮细胞（16HBE），以氯化氢创造细胞酸性环境（pH 6.4），以细胞外信号调节激酶（ERK）特异性抑制剂PD88059及卵巢癌G蛋白耦联受体1（OGR1）siRNA进行干预，将细胞随机分为8组：对照组、酸刺激组、酸刺激+转染OGR1siRNA组、pH 7.4+OGR1 siRNA组、酸刺激+阴性siRNA组、pH 7.4+阴性siRNA组、酸刺激+PD98059组、pH 7.4+PD98059组。采用RT-PCR、ELISA法分别观察细胞黏蛋白（MUC）5AC转录水平及培养上清液中MUC5AC蛋白水平的改变；Western blot法检测OGR1蛋白及p-ERK蛋白的相对含量。结果酸刺激组内细胞MUC5AC转录及蛋白水平显著高于对照组（P值均＜0.05），其OGR1及p-ERK蛋白含量较对照组亦明显增加，酸刺激+转染OGR1siRNA组MUC5AC mRNA转录及蛋白水平显著低于酸刺激组（P值均＜0.05），其p-ERK含量亦明显降低。而pH 7.4+OGR1siRNA组MUC5AC蛋白含量及mRNA水平较pH7.4对照组无明显差别，其p-ERK含量也变化不大。酸刺激+PD98059组MUC5AC mRNA转录及蛋白水平显著低于酸刺激组（P值均＜0.05），而pH 7.4+PD98059组较对照组MUC5AC mRNA转录及蛋白水平无明显差异。结论OGR1可能通过激活ERK信号通路参与气道酸性微环境所致的人气道黏膜上皮细胞MUC5AC表达。

黏蛋白；酸性环境；卵巢癌G蛋白耦联受体1；细胞外信号调节激酶

气道黏液高分泌是诸如慢性阻塞性肺疾病、哮喘等慢性气道炎症性疾病的重要病理特征［1］，大量研究结果显示慢性气道炎症性疾病多导致气道微环境酸化，而持久的气道酸性微环境进一步加重气道黏液高分泌，其最主要的病理性表达产物是气道黏蛋白（mucin，MUC）5AC［2］，但酸暴露下参与这一过程的具体信号转导途径尚有待明确。国外研究报道，G蛋白耦联受体家族中卵巢癌G蛋白耦联受体1（ovarian cancer G protein-coupled receptor 1，OGR1）作为一种质子敏感型受体，目前被众多研究证实参与酸性环境刺激下细胞信号调节通路。而细胞外信号调节激酶（extra cellular signal-regulated kinase，ERK）［3］作为多条信号转导路径的汇总点，有报道显示参与了其下游信号转导途径。鉴于ERK在气道黏蛋白5AC高表达的信号转导通路中居重要地位。故此，我们推测气道在酸性环境下激活OGR1可引起ERK活化，从而诱导MUC5AC病理性高表达。本研究旨在进一步探讨气道酸性环境下黏蛋白5AC过度表达的上游关键信号调节途径及其在气道黏液高分泌中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人支气管气道上皮细胞（16HBE）购自ATCC（美国），DMEM培养液、HEPES、Trizol、胎牛血清、抗β-actin单克隆抗体、ERK特异性抑制剂PD98059（Sigma，美国），OGR1siRNA和对照siRNA（吉凯，中国），小鼠抗MUC5AC单克隆抗体（45MI）（NeoMarkers，美国），兔抗磷酸化ERK多克隆抗体、HRP-羊抗兔抗体、HRP-羊抗小鼠抗体（Santa Cruz，美国），人MUC5AC ELISA试剂盒（R&D system，美国），Fu-GENE6试剂（Roche，美国）。

1.2 细胞培养及分组

于6孔板中培养16HBE细胞，每孔（5～6）×105个细胞，加入2 mL DMEM培养液（含10%牛胎血清，链霉素（100 μg/mL），青霉素（100 μg/mL），HEPES（25 mmol/L），37℃，5%CO2培养箱孵育，常规换液培养，当细胞达70%～80%融合时传代，将细胞分为8组，对照组：无胎牛血清无双抗的DMEM培养基中继续培养细胞，给予适宜浓度氯化氢使维持pH 7.4；pH 6.4组：细胞于无血清培养液、pH6.4培养；pH 6.4+OGR1siRNA组（转染OGR1 siRNA后，于无血清培养液、pH6.4培养）；pH 6.4+siRNA阴性对照组（以阴性siRNA转染后于无血清培养液；pH6.4培养）；pH 7.4+OGR1 siRNA组（以OGR1 siRNA转染后于无血清培养液；pH7.4培养）；siRNA阴性对照组（以阴性siRNA转染后，无血清培养液；pH7.4培养；pH 6.4+PD98059组（细胞给予ERK抑制剂PD98059 50 μmol/L后，无血清培养液；pH6.4培养）；pH 7.4+ PD98059组（细胞给予ERK抑制剂PD98059 50 μmol/L后，无血清培养液、pH7.4培养）。每组设5个复孔用于统计学分析（n=5），实验重复4次。

1.3 MTT法检测各组细胞活力

在96孔板里加入200 μL细胞悬液，每孔细胞密度约l×104/mL。每组8个复孔，分别在8、16、24及36 h时间点进行细胞活力测定。

1.4 细胞转染

OGR1siRNA试剂由中国吉凯生物化学有限公司合成，OGR1 siRNA序列为5′-CAA UUC AGG UUC CUC GCC G（dTdT）-3′，阴性siRNA序列为5′-GCG CGC UUU GUA GGA UUC G（dTdT）-3′。将处于对数生长期的细胞调整浓度至（1～2）×109/L，孵育12 h，当细胞融合达30%～50%时进行转染，操作步骤按FuGENE6说明书进行，以阴性siRNA为阴性对照，转染后24～48 h后进行细胞处理并行相关检测。

1.5 ELISA法测上清液MUC5AC蛋白含量吸取培养基上清液，40℃包被96孔酶标反应板，干燥，PBS清洗酶标板3次，2%小牛血清室温封闭1 h，加入小鼠单克隆MUC5AC抗体（1∶100，用含0.05%Tween-20的PBST稀释50 μL），孵育1 h；洗涤3次，加入辣根过氧化物酶-羊抗小鼠IgG（1∶10 000）孵育1 h；四甲基联苯胺过氧化物酶溶液显色，1 mol/L H2SO4终止反应后测各孔A值（λ=450 nm），与标准品比较而得到黏蛋白MUC5AC的相对值。

1.6 逆转录PCR检测MUC5AC mRNA

采用Trizol法分别提取各组细胞内的总RNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，测RNA在260 nm和280 nm的吸光度（A）值，样品A260/A280比值均介于1.8～2.0，根据260 nm的A值对样品的总RNA初步定量，保存于-20℃备用。随后以两步法行RTPCR。参照MMLV第一链cDNA合成试剂盒说明书合成cDNA第一链。MUC5AC的PCR引物序列（由生工生物工程有限公司提供）上游5′GAGGGCCCAGTGA GCATCTCC 3′，下游5′TGGGA-

CAGCAGCAGTATTCAGT 3′。灭菌PCR管中依次加入MgCl2（25 mmol/L）4.0 μL、10×PCR反应缓冲液5.0 μL、上下游引物各1.0 μL、dNTP 4.0 μL、cDNA 2.0 μL，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，定容至50.0 μL，轻轻混匀离心后行PCR扩增。于94℃预变性10 min，后紧随30个循环，循环参数：94℃30 s，57℃45 s，70℃45 s，后72℃延伸7 min补齐末端。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，约540 bp处为目的基因片段。电泳结果经光密度面积积分分析，以与βactin mRNA的比值作为目的基因mRNA的相对含量。

1.7 Western印迹分析相关蛋白含量

细胞加入冰预冷的裂解液，冰浴20 min，4℃12 000 r/min离心15 min，取上清液经8%聚丙烯酰胺（SOS）凝胶电泳分离，印迹转移至硝酸纤维素膜，于5%BSA中封闭1 h后，分别加入兔抗磷酸化ERK多克隆抗体（1∶1 000）和兔抗OGR1多克隆抗体（1∶500）4℃过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体（1∶10 000），37℃孵育1 h。彻底洗涤后经增敏化学发光法显色，加入底物与反应液后，显色5 min。结果经光密度面积积分分析，以与内参照βactin产物条带的比值作为相对含量。

1.8 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件包分析，多组数据间差异分析采用多组间单因素方差分析，两组间单因素分析采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组细胞活力

各组细胞在同一时间点吸光度无统计学差异（表1）。

表1 各组细胞在不同时间点增殖活力的比较Tab.1 The cellular proliferation activity of 16HBE at different time

表1 各组细胞在不同时间点增殖活力的比较Tab.1 The cellular proliferation activity of 16HBE at different time

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2.2 转染16HBE细胞表达情况的鉴定

Western blot结果显示OGR1siRNA转染后其表达蛋白明显减少，提示转染成功（图1）。

图1 Western blot检测OGR1沉默效率Fig.1 The expression of the OGR1 receptor in 16HBE cells measured by Western blot

2.3 各实验组MUC5AC mRNA转录水平及细胞培养上清液中MUC5AC分泌水平

给予培养液细胞维持pH值为6.4的酸性微环境后，与对照组相比，其MUC5AC mRNA转录水平明显上升（t=-33.67，P=0.000），而转染OGR1siRNA后几乎完全阻断酸暴露下上调的MUC5AC转录水平（t=18.06，P=0.000），而转染阴性siRNA组与对照组相比MUC5AC mRNA转录水平无统计学差异（t=-0.02，P=0.490）；未给予酸刺激的对照组分别与pH 7.4+阴性siRNA组、pH 7.4+OGR1siRNA组比较MUC5AC mRNA转录水平无统计学差异（t值分别为-0.46、0.38；P值分别为0.330、0.350）（表2）。细胞培养上清液中的MUC5AC蛋白分泌水平与MUC5AC mRNA转录水平变化一致（表2）。

2.4 酸性刺激及PD98059预处理对p-ERK及MUC5AC蛋白含量及mRNA转录水平的影响

pH 6.4+PD98059预处理后p-ERK含量（图2）、MUC5AC蛋白含量及mRNA转录水平较pH 6.4组显著降低（t=16.75，P=0.000），而pH 7.4+PD98059组的p-ERK含量（图2）、MUC5AC蛋白含量及mRNA转录水平与pH 7.4对照组相比差异无统计学意义（t=0.75，P=0.238）（表2）。

表2 各组细胞MUC5AC转录水平及培养上清中MUC5AC分泌水平Tab.2 The expression of MUC5AC protein and MUC5AC mRNA in 16HBE cells

表2 各组细胞MUC5AC转录水平及培养上清中MUC5AC分泌水平Tab.2 The expression of MUC5AC protein and MUC5AC mRNA in 16HBE cells

Compared with pH 7.4 control group：1）P＜0.05；compared with pH 6.4 group：2）P＜0.05.

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图2 酸刺激及PD98059预处理对ERK磷酸化水平的影响Fig.2 The effect of acidic stimulation and PD98059 on the phosphorylation level of ERK

2.5 酸刺激及转染OGR1siRNA对p-ERK蛋白含量影响

pH 6.4+OGR1siRNA组与pH 6.4组相比ERK的磷酸化水平明显下降，MUC5AC蛋白含量及水平也明显降低（P＜0.05），而pH 7.4+OGR1siRNA组p-ERK含量、MUC5AC蛋白及mRNA水平较对照组无明显影响，但均明显低于酸预处理组（P＜0.05）（图3，表2）。

图3 酸刺激及转染OGR1siRNA对ERK磷酸化水平的影响Fig.3 The effect of acidic stimulation and OGR1 siRNA on the phosphorylation level of ERK

3 讨论

气道酸性微环境是慢性气道炎症时小气道的普遍表现，正常人气道微环境pH在7.5～7.7，但慢性气道炎性疾病诸如哮喘患者气道微环境pH值多在5.2～7.1之间［4］，故本实验选择pH 6.4中间值作为对照研究，许多研究已经表明质子敏感型离子通道包括对酸刺激及辣椒素敏感的瞬时感受器阳离子通道［5］等在酸诱导的各种病理生理表现如气道狭窄、气道高反应性、高分泌中扮演了重要的角色，但是目前对于气道酸环境所致的各种病理性改变信号通路机制仍不清楚。

质子敏感G蛋白耦联受体家族，包括诱导细胞停滞于G2/M期的G蛋白耦联受体G2A（G2 accumulation）、T细胞死亡耦联基因8（T cell death associated gene 8，TDAG8）、G蛋白耦联受体4（G protein coupled receptor 4 GPR4）及OGR1，在人体组织细胞中广泛分布，但只有OGR1和GPR4高表达于肺组织中。该类受体能通过组氨酸残基感知胞外质子或pH值的变化［6］，从而介导细胞内多种信号通路。有研究提示OGR1在pH7.4～7.6范围内即可被激活，而进一步实验发现在pH6.4～6.8范围可被充分激活［7］。国外报道质子敏感型受体OGR1可介导气道酸性微环境所致的气道平滑肌收缩［8］、气道重塑，还可刺激IL-6的产生，而IL-6作为前炎性因子，在哮喘气道炎性反应中起重要作用［9］，研究表明OGR1还可通过OGR1/Gq/PLC信号通路介导［Ca2+］依赖的MUC5AC出胞［10］。故OGR1在气道炎性疾病导致的各种病理生理改变有重要作用，可能是酸性环境下MUC5AC mRNA高表达的上游信号调节的重要靶点，并在气道黏液高分泌的形成中发挥关键作用。

本研究显示酸暴露下气道MUC5AC mRNA及其蛋白表达明显增强，而转染OGR1siRNA后明显

降低由酸性微环境所致的气道MUC5AC mRNA及其蛋白含量，较未给予酸暴露的对照组相比差异明显，此研究结果与国外在其他系统的研究结论相同，证实了OGR1可能是气道上皮细胞接收酸刺激信号的重要膜靶点，其在接收酸刺激信号后进一步向胞内传导，从而引发气道酸性微环境下的黏液高分泌。

ERK是多条信号转导通路的共同汇总点，已有报道低pH环境下可诱导人A431细胞ERK磷酸化增强［11］。在胃食管返流患者中，食管低pH环境可增强ERK的表达，促进食管细胞的增殖［12］。目前已公认ERK在各种因素诱导的气道MUC5AC高表达信号转导通路中居重要地位。

本研究结果发现，在酸性微环境中p-ERK表达明显增强，给予其特异性抑制剂PD98059后ERK的活化减弱，且实验中MUC5AC mRNA及其蛋白含量也明显降低，进一步实验发现，转染OGR1siRNA的实验组中p-ERK含量明显降低，说明抑制OGR1的表达能降低p-ERK的水平，提示酸暴露下ERK的激活有赖于OGR1的作用。上述研究结果表明，OGR1能通过活化ERK诱导MUC5AC mRNA及其蛋白的高表达，从而参与酸暴露所致的黏液高分泌形成过程。

综上所诉，本研究探讨了酸暴露下气道MUC5AC mRNA及其蛋白高表达的上游信号分子，提示OGR1/ERK途径可能是其主导信号通路，研究结果进一步完善了对慢性气道炎症时黏液高分泌形成机制的认识，也提供了一个可能有现实意义的干预靶点。

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（编辑 裘孝琦）

Study of OGR1/ERKMediated Mechanism for the Acid-induced Mucin 5ACExpression and Secretion in Human Airway Epithelial Cells

ZHOUWan1，ZHOU Xiang-dong1，Juliy M.Perelman2，VictorP.Kolosov2
（1.Department of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China；2.Far Eastern Scientific Center ofPhysiology and Pathology ofRespiration，Siberian Branch，Russian Academy ofMedicalSciences，Blagoveshchensk 675000，Russia）

ObjectiveTo explore the related signal transduction mechanism in acid-induced expression of MUC5AC mRNA by airway epithelial cells.Methods16HBE cells were stimulated by hydrogen chloride，and treated with OGR1siRNA and an inhibitors to ERK（PD98059）.Cells were divided into 8 groups：the control group（pH 7.4），the acidic stimulation group（pH 6.4），the acidic stimulation+OGR1siRNA group，the pH 7.4+OGR1siRNA group，the acidic stimulation+control siRNA group，the pH 7.4+control siRNA group，the acidic stimulation+PD98059 group，and the pH 7.4+PD98059 group.The transcription level of mucin（MUC）5AC was evaluated with reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.The MUC5AC secreted in supernatant was measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expression of OGR1 protein and the protein levels of phosphorylation extracellular signal-regulated kinase（p-ERK）were measured by Western blot.ResultsThe expression of MUC5AC mRNA and MUC5AC protein levels were remarkably higher in the acidic stimulation group compared with those in the control group（P＜0.05）.The expression of OGR1and p-ERK protein also significantly increased.The expression of MUC5AC mRNA and MUC5AC protein levels in the acidic stimulation+OGR1siRNA group were also significantly lower than those in the control group and its p-ERK decreased remarkably.There is no significant difference in expression of MUC5AC mRNA and mRNA level between the control group and p-ERK also showed no significant change after transfection of OGR1siRNA.The secretion level of MUC5AC and the expression of MUC5AC mRNA were much lower in the acidic stimulation+PD98059 group than in the acidic stimulation group（P＜0.05），while there were no significant difference between the control group and the pH 7.4+PD98059 group in the secretion levelofMUC5AC and expression of MUC5AC mRNA（P＞0.05）.ConclusionOGR1/ERK transduction cascade may be uppersignalregulatorsin acid-induced MUC5ACexpression in 16HBE cells.

MUC5AC；acidic stimulation；ovarian cancer G protein-coupled receptor 1；extra cellular signal-regulated kinase

R310.17

A

0258-4646（2014）02-0122-05

国家自然科学基金（81370111）；国家自然科学基金中俄国际合作项目（31211120168）

周万（1988-），男，硕士，研究生.

周向东，E-mail：zxd999@263.net

2013-11-12

网络出版时间：