甲状腺乳头状癌组织中CXCR7mRNA和蛋白表达的生物学意义

（中国医科大学附属盛京医院普通外科，沈阳110004）

甲状腺乳头状癌组织中CXCR7mRNA和蛋白表达的生物学意义

刘臻，滕绪永，张恒玮，张雷

（中国医科大学附属盛京医院普通外科，沈阳110004）

目的研究甲状腺乳头状癌组织中趋化因子受体CXCR7mRNA和蛋白的表达，探讨其表达在甲状腺乳头状癌发生、发展中作用。方法采用实时荧光定量PCR和Western blot检测79例甲状腺乳头状癌和癌旁组织标本中CXCR7mRNA和蛋白的表达，分析CXCR7表达与临床病理特征之间的相关性。结果甲状腺乳头状癌组织中CXCR7mRNA和蛋白的表达水平分别为1.61±0.80和1.101 4±0.693 8，明显高于癌旁组织的0.74±0.45和0.092 7±0.096 1（均P＜0.05）。CXCR7mRNA和蛋白的表达与甲状腺乳头状癌淋巴结转移相关，淋巴结转移组中CXCR7mRNA和蛋白表达水平分别为1.87±0.72和1.444 3±0.671 0，明显高于非淋巴结转移组的1.30±0.79和0.691 7±0.463 9（均P＜0.05）；CXCR7蛋白表达与TNM分期相关，Ⅲ～Ⅳ期中CXCR7蛋白表达为1.534 1±0.673 2，明显高于Ⅰ～Ⅱ期的0.954 6±0.642 1（P＜0.05）。结论CXCR7高表达与甲状腺乳头状癌的淋巴结转移、分期相关，参与了甲状腺乳头状癌的发生、发展。

甲状腺肿瘤；趋化因子受体；CXCR7；转移

甲状腺癌是常见的内分泌恶性肿瘤，甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见的病理类型，约占甲状腺癌的80%。甲状腺乳头状癌易发生颈部淋巴结转移。越来越多的研究显示趋化因子及其受体网络参与了肿瘤发生、侵袭及转移的多个环节。CXCR7是近年来发现的趋化因子受体，与其配体CXCL12结合后能调节细胞的增殖、生存、黏附等功能，并参与肿瘤的侵袭和转移［1～5］。本研究应用实时定量PCR和Western blot检测甲状腺乳头状癌及相应癌旁组织中CXCR7mRNA和蛋白的表达，探讨CXCR7在甲状腺乳头状癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取2010年6月5日至2011年11月18日在中国医科大学附属盛京医院普外科行手术治疗患者的甲状腺乳头状癌标本79例，留取癌组织及癌旁2 cm组织，置液氮后转入-80℃冰箱保存。癌旁2 cm组织经病理证实未发现癌细胞。所有留取的标本

均获患者知情同意，并且有完整的临床资料。

1.2 主要仪器与试剂

PCR引物、Trizol试剂、反转录试剂盒Prime-Script RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR染料法实时PCR试剂盒，购自日本TaKaRa公司。兔抗人CXCR7抗体，购自美国Proteintech公司。小鼠抗人GAPDH抗体，购自上海康成生物公司。辣根酶标记山羊抗兔IgG和辣根酶标记山羊抗小鼠IgG，购自北京中杉金桥技术公司。超敏ECL化学发光试剂盒，购自碧云天生物技术公司。

1.3 实时荧光定量PCR

1.3.1 总RNA提取和cDNA合成：取60 mg组织标本，于液氮研磨成粉末，加入1 mL Trizol，匀浆处理。按照Trizol试剂说明书，一步法提取组织总RNA。提取的总RNA经紫外分光光度计检测，各样本的A260/A280比值在1.8～2.0，总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。提取的总RNA保存于-80℃，用于逆转录。逆转录反应体系和条件均参照反转录试剂盒中的说明进行，逆转录反应体系20 μL，反应条件为37℃15 min，85℃5 s。合成的cDNA于-20℃下保存，待扩增。

1.3.2 实时PCR反应：实时PCR在ABI7500 Realtime PCR仪中进行，反应体系20 μL：SYBR预混液10 μL，上下游引物（5 μmol/L）各1 μL，校正液ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA模板2 μL，双蒸水5.6 μL。扩增条件：95℃30 s，1个循环；95℃5 s，60℃34 s，40个循环。目的基因CXCR7引物：上游为5′-AGCATCAAGGAGTGGCTGAT-3′，下游为5′-TGTGCTTCTCCTGGTCACTG-3′，产物136 bp；内参照基因GAPDH引物：上游为5′-ACAGTCAGCCG CTTCTT-3′，下游为5′-GCCCAATACGACC AAATCC-3′，产物101 bp。根据荧光信号，检测出每个反应体系中待测基因的Ct值。每个样本均做3个复孔，取Ct值的平均值进行分析。CXCR7的基因相对表达量用2-△△Ct方法来分析。具体公式：△△Ct=［CtCXCR7（未知样品）-CtGAPDH（未知样品）］-［CtCXCR7（校正样品）-CtGAPDH（校正样品）］，以癌旁组织的平均Ct值作为校正，阴性对照用双蒸水代替cDNA模板。

1.4 Western blot检测

取80 mg组织标本，加入蛋白裂解液1 mL，匀浆裂解，12 000 g、4℃、10 min离心后，取上清液测定蛋白浓度。取20 μg蛋白加入上样缓冲液，煮沸变性5 min，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，蛋白通过湿转转移到PVDF膜，含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭60 min，用1∶400的兔抗人CXCR7单克隆抗体于4℃孵育过夜，另用1∶15 000的鼠抗人GAPDH单克隆抗体作为内参。加入相应的二抗（1∶2 000），室温下孵育90 min。底物化学发光ECL呈色。采用IPP图像分析系统分析目的蛋白及内参蛋白的积分光密度（integral optical density，IOD）值，以IOD的比值（CXCR7的IOD值/GAPDH的IOD值）作为CXCR7蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 甲状腺乳头状癌和癌旁组织中CXCR7mRNA和蛋白的表达

2.1.1 甲状腺乳头状癌与癌旁组织中CXCR7 mRNA表达：甲状腺乳头状癌和癌旁组织中，CXCR7mRNA的阳性标本荧光定量扩增曲线呈典型的S型曲线（图1），溶解曲线为单峰（图2），排除非特异性扩增及引物二聚体的出现。甲状腺乳头状癌与癌旁组织中CXCR7mRNA相对表达量分别为1.61±0.80和0.74±0.45，甲状腺乳头状癌组织中CXCR7mRNA表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义（t=9.736，P＜0.05）。

图1 甲状腺乳头状癌和癌旁组织中CXCR7mRNA荧光定量扩增曲线Fig.1 The amplification curves of CXCR7 mRNA acquired from real⁃time PCR analysis in PTC and paracancerous tissue

图2 甲状腺乳头状癌和癌旁组织中CXCR7 mRNA荧光定量融解曲线Fig.2 The melt curves of CXCR7 mRNA acquired from real⁃time PCR analysis in PTC and paracancerous tissue

2.1.2 甲状腺乳头状癌和癌旁组织中CXCR7蛋白的表达：与相应的癌旁组织相比，CXCR7蛋白在甲状腺乳头状癌组织的表达明显升高，CXCR7蛋白在甲状腺乳头状癌中的相对表达量为1.101 4±0.693 8，在癌旁组织中为0.092 7±0.096 1，二者差异有统计学意义（t=13.583，P＜0.05）（图3）。

2.2 CXCR7mRNA和蛋白表达与甲状腺乳头状癌临床病理特征的关系

图3 Western blot检测甲状腺乳头状癌与癌旁组织CXCR7蛋白Fig.3 Detection of CXCR7 protein in PTC and paracancerous tissue by Western blot

CXCR7mRNA表达与甲状腺乳头状癌淋巴结转移有关，淋巴结转移组和非转移组中CXCR7 mRNA相对表达量分别为1.87±0.72和1.30±0.79，2组之间差异有统计学意义（t=3.356，P＜0.05）。CXCR7蛋白表达与甲状腺乳头状癌淋巴结转移、TNM分期有关，淋巴结转移组和非淋巴结转移组中CXCR7蛋白相对表达量分别为1.444 3±0.671 0和0.691 7±0.463 9（t=5.868，P＜0.05），TNMⅢ～Ⅳ期和Ⅰ～Ⅱ期组CXCR7蛋白表达量分别为1.534 1± 0.673 2和0.954 6±0.642 1（t=3.446，P＜0.05）。CXCR7mRNA和蛋白表达与性别、年龄、肿瘤大小、病灶数目、被膜外侵犯无关（P＞0.05）。见表1。

表1 甲状腺乳头状癌CXCR7mRNA和蛋白表达与临床病理特征的关系Tab.1 Correlation between expressions of CXCR7 mRNA and protein and clinicopathological characteristics in papillary thyroid carcinoma

3 讨论

趋化因子及其受体是一类重要的细胞因子，不仅参与胚胎发育、炎症、造血，而且参与肿瘤发生、发展、侵袭及转移［6］。CXCR7是近年新发现的趋化因子受体，与其配体CXCL12结合后在肿瘤发生、发展和转移过程中发挥重要作用［7，8］。研究报道，CXCR7高表达于多种肿瘤细胞系及多种恶性肿瘤，但正常细胞和相应的非恶性转化的组织几乎不表达CXCR7蛋白，只能通过Northern blot检测到CXCR7mRNA的表达，并推测CXCR7蛋白是通过翻译后方式进行调节［7～10］。我们之前采用免疫组化方法检测了甲状腺乳头状癌及癌旁组织中CXCR7和CXCL12蛋白表达，发现癌组织中CXCR7和CXCL12蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织，CXCR7和CXCL12蛋白阳性表达与淋巴结转移相关；且CXCR7和CXCL12蛋白表达呈正相关趋势，提示CXCR7和CXCL12参与了甲状腺乳头状癌的发生、发展［11］。本研究采用实时荧光定量PCR、Western blot进一步检测甲状腺乳头状癌及癌旁组织中CXCR7mRNA和蛋白水平的表达，无论在mRNA水平还是蛋白水平上，CXCR7在甲状腺乳头状癌中的表达明显高于癌旁组织，表明在甲状腺乳头状癌中CXCR7在转录水平即开始调节，这与Burns等［7］和邱明远等［12］提出的CXCR7的表达是通过翻译后修饰或转录后调控进行调节的观点不同，提示在不同组织中CXCR7表达的调控方式可能不同。

研究报道CXCR7能促进肿瘤细胞的生长增殖、血管生成及细胞间黏附，参与了肿瘤的发生、侵袭与转移［7，9，13］。邱明远等［12］报道，结直肠癌组织中CXCR7蛋白的表达与淋巴结转移、肿瘤分期相关。Iwakiri等［2］报道在Ⅰ期非小细胞肺癌中，CXCR7高表达与术后远处转移和低生存率相关。本研究分析了CXCR7mRNA和蛋白表达水平与甲状腺乳头状癌临床病理特征的关系，发现淋巴结转移组的CXCR7mRNA和蛋白表达水平明显高于非转移组，而且CXCR7蛋白表达和临床分期有关，TNMⅢ～Ⅳ期中CXCR7的蛋白表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期，提示CXCR7高表达可能对甲状腺乳头状癌淋巴结侵袭、转移起到一定的促进作用。本研究中CXCR7 mRNA和蛋白表达水平与临床分期的关系不一致，可能与本组病例数少有关，也提示在甲状腺乳头状癌中CXCR7蛋白表达除了转录水平的调节，在转录后也可能存在调控，需要进一步研究。目前CXCR7在肿瘤中的作用机制还不是很清楚，Wang等［14］在前列腺癌的研究中发现，CXCR7可能通过激活AKT信号通路和上调白细胞介素8或血管内皮生长因子的表达来调控肿瘤的血管生成及发展；并可调节钙黏连蛋白11、纤维连接蛋白1及基质金属蛋白酶3、10、11等的水平，增强前列腺癌细胞的侵袭与转移能力。Grymula等［15］报道CXCR7能通过诱导MAPK p42/44DE磷酸化来促进横纹肌肉瘤细胞的增殖、侵袭。Barbero等［16］发现CXCR7还能通过活化ERK1/2信号通路诱导胶质瘤细胞的增殖。这些研究均表明CXCR7能通过多种途径增强肿瘤细胞的侵袭性及转移性。

综上所述，CXCR7高表达与甲状腺乳头状癌的淋巴结转移、分期相关，参与了甲状腺乳头状癌的发生、发展，但具体机制仍需要进一步研究。选择性阻断CXCR7，可能是控制甲状腺乳头状癌的淋巴结转移的一个有效途径。

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（编辑 陈姜）

Expression of Chemokine Receptor CXCR7in Papillary Thyroid Carcinoma and Its BiologicalSignificance

LIU Zhen，TENGXu-yong，ZHANGHeng-wei，ZHANGLei
（DepartmentofGeneralSurgery，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the mRNA and protein expression of chemokine receptor CXCR7in papillary thyroid carcinoma and explore its biologicalfunction.MethodsThe expression of CXCR7mRNAand protein in 79 cases ofpapillary thyroid carcinoma and paracancerous tissues was detected by real-time quantitative PCR and Western blot.The association between CXCR7expression and clinicopathological characteristics in papillary thyroid carcinoma was analyzed.ResultsThe expression of CXCR7 mRNA and protein（1.61±0.80，1.101 4±0.693 8）was significantly higher in papillary thyroid carcinoma than in paracancerous tissues（0.74±0.45，0.092 7±0.096 1）（P＜0.05）.The expression of CXCR7mRNA and protein was correlated with lymph node metastasis.The expression level of CXCR7 mRNA and protein in the group with lymph node metastasis（1.87±0.72，1.444 3±0.671 0）was higherthan in the group withoutlymph node metastasis（1.30±0.79，0.691 7±0.463 9）（P＜0.05）.The levelof CXCR7 protein was relevant to TNM stages.The level of CXCR7 protein in stageⅢ-Ⅳ（1.534 1±0.673 2）was higher than in stageⅠ-Ⅱ（0.954 6± 0.642 1）（P＜0.05）.ConclusionThe high expression of CXCR7was related with lymph node metastasis and TNM stages.CXCR7may be involved in the tumorigenesis and progression ofpapillary thyroid carcinoma.

thyroid neoplasm；chemokine receptor；CXCR7；metastasis

R736.1

A

0258-4646（2014）02-0114-05

国家自然科学基金（81072182）；辽宁省自然科学基金（2013021100）

刘臻（1973-），男，副教授，博士.

E-mail：liuzhen1973@aliyun.com

2013-12-19

网络出版时间：