复合酶与酵母菌协同发酵葡萄皮渣生产猪饲料

周 广 麒，陈 成，齐 文 茂，曹 照 平，张 伟 丽，任 彩 侠

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引 言

葡萄酒工厂将葡萄压榨后会产生大量皮渣，通常有两种处理方法：一是作为粗饲料出售，不做加工，其营养价值比较低；二是作肥料倾倒或掩埋，但容易滋生病菌，污染环境。

葡萄皮渣中含有较多的纤维物质，能快速通过猪的胃肠，导致养分的吸收利用率降低，因此会降低饲料利用效率［1］。纤维素酶和木聚糖酶等组成的复合酶不但能降低粗纤维的含量，还能消除抗氧化因子，有效提高饲料的适口性和饲料的营养价值［2］，对仔猪的生长也具有较大的促进作用［3］。饲料中添加酵母菌已被广泛的应用［4］，酶解后所产生的糖可用于酵母菌的生长，不仅可以提高饲料蛋白的品质［5］，还能产生香味物质，促进猪的食欲。增加葡萄皮渣在配合饲料中所占的比例能降低饲料的成本，增加效益；但是比例过大，也会降低营养物质的均衡以及饲喂的效果［6］，所以选择合适的配合比例至关重要。本研究将葡萄皮渣与辅助农副产品豆粕、麸皮和玉米面等配合，经由复合酶降解和酵母发酵获得多量的细胞蛋白，依据猪饲料国家标准制成配合饲料。

1 材料与方法

1.1 材 料

葡萄皮渣，辽宁五女山米兰酒业有限公司；豆粕、麸皮，大连棒棰岛食品集团调味食品厂；玉米面，市售；复合酶（纤维素酶和木聚糖酶等），黑龙江肇东国科酶制剂有限公司；酿酒酵母，广东丹宝利酵母有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄皮渣饲料发酵工艺

原料→筛选→混合→加水→润料→灭菌→冷却→加酶→翻拌→降温→接种酵母→发酵→干燥→粉碎→成品。

1.2.2 操作要点

原料处理：剔除葡萄皮渣中的土块、石头等杂物。

原料混合：将原料葡萄皮渣、豆粕、麸皮和玉米面等按一定比例混合。

润料：原料与水按照质量比2∶1充分润透，混合均匀，要求散而不凝，没有结团。

灭菌条件：121 ℃蒸汽灭菌60min。

加入复合酶：将灭菌后的原料冷却至室温，于无菌室中加入复合酶。加酶量分别为：纤维素酶2.0、2.5、3.0U／g；木聚糖酶5、6、7U／g。

酶解：在50℃下恒温72h，每日晃瓶2次，使发酵物松散、均匀。

接种活化酵母：活性干酵母按0.05%加入，使用前取适量无菌水，25 ℃活化2h。

酵母发酵：在30 ℃培养箱内发酵96h。

热风干燥：将发酵饲料摊于浅盘中，50 ℃热风风干12～24h。

1.3 检测方法

1.3.1 水分的测定

根据GB／T 6435—2006采用直接干燥法。

1.3.2 蛋白质的测定

采用微量凯式定氮法［7］。

1.3.3 粗纤维的测定

根据GB／T 6434—2006采用过滤法。

1.3.4 灰分的测定

根据GB／T 6438—2007采用灼烧法。

1.3.5 还原糖得率

采用DNS法［8－9］测定水解液中还原糖质量分数：将试样放置在50 ℃的烘箱中12h，粉碎均匀后精确称取1.000 0g，加入适量去离子水，50 ℃水浴30 min，待溶液冷却后定容至100 mL，再3 000r／min离心5 min，取 上清液1 mL 进行DNS法检测，根据葡萄糖溶液标准曲线确定还原糖质量分数。

式中：m1为酶解后的还原糖的质量，g；m0为初始还原糖的质量，g；m2为50 ℃烘干试样的质量，g；w为50 ℃烘干试样的含水率，%。

1.3.6 总糖的测定

精确称取原料试样，经过酸水解、碱中和后定容，离心，采用DNS法测定。

1.3.7 酵母菌数的测定

称取10.00g发酵后饲料，加入50mL 去离子水浸泡2min，上清液定容至250mL，采用血球计数板直接计数法测定。

2 结果与讨论

2.1 原料主要成分

葡萄皮渣由于加工的方式不同，其化学组分含量也会有所差别。根据猪饲料的国家（行业）标准［10］，饲料配伍中必须兼顾碳水化合物、有机氮、粗纤维物质等主要成分的比例，以及在饲料中的质量分数［11］。试验用的葡萄皮渣来自冰葡萄酒的压榨原料。测定的主要成分结果见表1。表中也给出了豆粕、玉米面以及麸皮等拟配合农副产品的检测结果。

表1 原料营养成分的质量分数Tab.1 Nutritional components of raw materials %

由表1可见，葡萄皮渣中总氮含量较少，糖含量偏低，需采用其他农副产品补充其不足部分。玉米面含糖量较高，豆粕含氮量最高，麸皮的含氮量和含糖量适中，都是很好的营养源。

2.2 饲料配比

根据表1中原料的主要营养成分以及各种营养物质搭配的原则［11］，在预试验的基础上设计成3种饲料配合比例，见表2。

表2 几种发酵物料的配合比例Tab.2 The proportion of several fermentation materials

配比的设计要考虑到尽可能多地利用葡萄皮渣，同时还要兼顾总氮等其他因素。由表2可知，虽然3 个配比中粗纤维质量分数最小值是13.15%，却仍然达不到国家（行业）标准粗纤维质量分数≤11.77%（绝干）［10－11］的要求，因此需要复合酶降解一部分粗纤维以达到标准。

2.3 葡萄皮渣配合饲料的干燥温度

制成的葡萄皮渣猪饲料需经过干燥，然后粉碎并取样检测。为了减少干燥时被检测组分的损失，同时保证取样均匀一致，采取风干方式。将发酵饲料在不同温度下热风干燥12h，检测其中还原糖的变化。试验从30～100℃，间隔10℃为一个梯度。结果见图1。

图1 温度对饲料中还原糖的影响Fig.1 The influence of temperature on reducing sugar in feed

在30～50 ℃时，美拉德反应速度缓慢，饲料中还原糖损失比较少；超过50℃则糖的损失明显加快。所以本试验确定热风干燥条件为50 ℃、12h。此时水分已较低，可以方便地进行粉碎、取样。50 ℃热风干燥温度也比较容易控制，具有能耗少、时间短、营养成分保留完好的优点，适宜在生产中应用。

2.4 复合酶酶解工艺

影响复合酶水解的主要因素，包括底物配比、加酶量、作用温度和时间等。在葡萄皮渣配合饲料的3种配比中，粗纤维含量各不相同，因而酶解的底物量也不同。纤维素酶和木聚糖酶的比例直接影响复合酶的酶解效率。最佳工艺条件采取正交试验法确定，选择正交表L9（34）。根据表2和图1的结果，因素水平表如表3所示。

按照正交试验设计方案L9（34）进行饲料（配比）中的粗纤维降解试验，分别检测9组试验组合中的还原糖并计算得率，结果列于表4中。

将表4中极差分析结果最次要的因素B 作为空列，进行方差分析，结果见表5。因素A 影响较显著，因素C和D 均为影响显著。因素作用的主次作用顺序是D＞C＞A，最优水平组合为A2C3D3。复合酶的3种配比水平影响不大，因此考虑到复合酶的成本因素，因素B 选择B1，则最优组合为A2B1C3D3，即酶解最优条件为：配比二——葡萄皮渣、豆粕、麸皮、玉米面质量比为2∶2∶1∶2，纤维素酶加入3U／g原料，木聚糖酶加入5U／g原料，酶解温度为50 ℃，时间72h。

表3 复合酶水解L9（34）正交试验的因素和水平Tab.3 Factors and levels of enzymatic hydrolysis L9（34）orthogonal test

表4 复合酶水解L9（34）正交试验结果Tab.4 Results of enzymatic hydrolysis L9（34）orthogonal experiment

表5 复合酶水解正交试验结果方差分析Tab.5 Variance analysis of enzymatic hydrolysis orthogonal test result

由于最优工艺条件组合没有含在表4的9组试验中，需要进行验证试验，结果还原糖得率为4.70%，高于表4中最好的A1B3C3D3组合的结果。

2.5 发酵过程中还原糖含量的变化

通过酵母菌发酵可以进一步软化饲料，同时产生酒香和酯香气味，提高饲料的适口性和营养价值。将3 种饲料配比（表2）分别经过酶解以后，接种0.05%活性干酵母，从72h开始发酵至168h，共计4d，发酵温度为30 ℃。降糖曲线见图2。

图2 发酵过程中还原糖的变化Fig.2 The change of reducing sugar in fermentation process

由图2可见，在72h之前，发酵物中还原糖的生成基本上符合正交试验优化的结果（表5）。0～24h阶段产糖速率较快，说明此时复合酶酶活是最高的；24～72h阶段还原糖增速减缓。从72h开始，在酵母菌发酵作用下，还原糖降至1%～2%。

2.6 发酵过程中酵母数量的变化

酵母菌发酵从72h 开始。3 种饲料配比中酵母菌生长过程曲线见图3。

图3 发酵过程中酵母数量的变化Fig.3 The change of yeast count in fermentation process

由图3可见，3组配比中的酵母数量在72～96h增长很快，而后逐渐缓慢。组二和组三的酵母生长比较旺盛，至168h时达到1.6×106个细胞，是发酵前的8倍左右，而组1中的酵母菌生长缓慢。发酵后期，由于还原糖被消耗，产物不断生成，酵母生长速率降低。

2.7 发酵前后饲料中主要成分含量的变化

葡萄皮渣、豆粕、麸皮和玉米面按一定的比例配合，经复合酶酶解和酵母菌发酵后，粗纤维含量明显降低，酒味和酯味比较突出。表6为发酵前后配合饲料中总氮和粗纤维含量的变化数据。将较优的第2组配比饲料制成后，经过50 ℃热风干燥24h后测定总氮和粗纤维含量，结果见表6所示。

表6 饲料主要成分的变化Tab.6 The change of main components in feed

由表6可见，配比二在发酵前后总氮含量变化不大，一部分饲料的蛋白质在酵母发酵过程中转变成菌体蛋白，提高了饲料蛋白的品质。发酵后粗纤维降低了4.83%，低于饲料行业标准；消化能值根据化学成分和总能计算［12］为13.53 MJ／kg，略高于饲料行业标准。

3 结 论

葡萄皮渣配合饲料最适配合比例：葡萄皮渣、豆粕、麸皮、玉米面质量比为2∶2∶1∶2。复合酶的最佳配比为：纤维素酶3 U／g，木聚糖酶5U／g，作用温度为50 ℃，时间为72h。发酵后的饲料成品中总氮18.81%，粗纤维11.42%，消化能值13.53 MJ／kg，均达到了国标（行业）妊娠猪饲料要求。

研究发现，葡萄皮渣含有少量的糖分，氮含量偏低。脱水可以提高氮的含量，但同时也会增加粗纤维的含量。将豆粕、麸皮、玉米面与葡萄皮渣配合可以弥补葡萄皮渣的不足，但是粗纤维含量稍高于饲料行业标准［10］。以纤维素酶和木聚糖酶为主的复合酶可以降解饲料粗纤维。试验中，复合酶将葡萄皮渣占27.2%的配比二中的粗纤维降低了4.83%，使之符合饲料标准。同时，最优的酶解条件A2B1C3D3将还原糖得率提高至4.70%，为酵母菌生长和发酵提供了良好条件。

发酵饲料经过50℃热风干燥后，主要营养成分和风味物质基本无损失，产品中含有少量还原性糖，其中的酵母菌也是优良的蛋白质资源［13］，蛋白质含量大为提高。干燥的葡萄皮渣饲料成品有酒香、酯香和原料香味，提高了饲料的适口性。

葡萄皮渣配合饲料较普通配合饲料节约了成本，增加了经济效益。饲料中还可加入乳酸菌［14］，有助于营养物质的消化和吸收，提升饲料的品质。饲料中赖氨酸［15］的含量和磷、钙［16］的含量也是影响饲料品质的因素，有待于进一步研究。

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