β－桐酸抑制膀胱癌T24细胞生长及其与ROS的关系

李 倩，王 晗，孙 仲 琰，叶 淑 红，肖 珊，谢 煜 萍，王 际 辉

（大连工业大学 食品学院，辽宁 大连 116034）

0 引 言

β－桐酸（β－ESA）（t9，t11，t13－18：3）是共轭亚麻酸的一组位置和几何异构体，少量存在于种子油中［1］，可经α－桐酸异构化生成［2］。近年来研究表明，β－桐酸具有抗癌、降血脂、减肥等一系列有益的生理功能，因而引起了研究人员的极大兴趣［3－4］。已有研究表明β－桐酸可以抑制结肠癌细胞caco－2 生长，且作用比α－桐酸更显著［5］，但β－桐酸抑制癌细胞生长的内在机制并不清楚。 本实验采用不同浓度的β－桐酸处理人膀胱癌细胞T24，通过研究ROS的产生及GSH 含量的变化，初步探究β－桐酸抑制T24细胞生长的可能机制。

1 实 验

1.1 材料与试剂

α－亚麻酸、β－桐酸，美国Cayman化学公司；膀胱癌T24 细胞，中国科学院细胞库；RPMI－1640细胞培养液，美国Sigma 公司；胎牛血清，美国HyClone 公 司；2′，7′－二氯荧光素双乙酸盐，DCFH－DA，杭州碧云天生物技术研究所；四甲基偶氮唑盐MTT，美国Sigma公司；谷胱甘肽检测试剂盒，南京建成生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

酶标仪，TECAN SUNRISE，奥地利TECAN公司；荧光分光光度计，RF－5301PC 型，日本岛津公司。

1.3 实验条件

1.3.1 细胞培养

将T24 细胞接种于含10% 胎牛血清、100IU／L青霉素、100μg／L链霉素的RPMI－I640培养基（pH 7.2～7.4），于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。传2～3代后，取对数生长期细胞用于实验。

1.3.2 MTT 实验检测细胞活力

取对数生长期T24细胞以1×105个／mL 的密度接入96孔板，37 ℃、5%CO2培养24h后，换无血清培养基同步化。4h 后，加入终浓度为10、20、40、80μmol／L的α－亚麻酸和β－桐酸，每个浓度设6个重复实验。继续培养24h后，每孔加入终质量浓度为5 mg／mL 的MTT，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养4h后，小心吸弃上清液，每孔加入DMSO 150μL，静置10 min 后振荡60s，于酶标仪上测570nm 处吸光度。NAC 拮抗β－桐酸作用的实验中，细胞随机分为4组：对照组、20μmol／Lβ－桐酸、10 mmol／L NAC、β－桐酸和NAC共培养。各组加入相应药物处理后，培养24h，按前文方法测定吸光度值。细胞存活率＝实验组A值／对照组A值×100%。

1.3.3 ROS水平的测定

取对数生长期T24细胞2～5×105个／mL接种于6孔板，细胞随机分为2组：20μmol／Lβ－桐酸，20μmol／Lβ－桐酸加入10 mmol／L NAC，各组加入相应药物处理0、24、48h后，胰酶消化，重悬，计数1×105个T24 细胞，加入含20μmol／L DCHF－DA 的PBS，37 ℃避光孵育30min，用PBS洗2遍，洗去多余荧光，用荧光分光光度计在激发光480nm，发射光530nm 处检测各处理组的荧光强度。

1.3.4 GSH 质量分数的测定

取对数生长期T24细胞2～5×105个／mL接种于6孔板，细胞随机分为4个处理组：对照组，20μmol／Lβ－桐酸、10 mmol／L NAC、β－桐酸和NAC 共培养，各组加入相应药物处理后，培养24h，收集细胞，PBS漂洗2次，重悬细胞，反复冻融，使细胞充分裂解。按照谷胱甘肽检测试剂盒要求，采用DNTB 法测定GSH 质量分数，用Bradford法测定蛋白含量。每个实验重复3次。

1.3.5 统计学分析方法

实验数据以x±sd表示，采用Origin Pro7.5进行t检验分析。P＜0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 β－桐酸对T24细胞活力的影响

如图1所示，随着β－桐酸处理浓度的升高，膀胱癌细胞T24存活率显著下降，且呈明显剂量相关性（P＜0.05）。与12h处理组相比，β－桐酸处理细胞24h后，20和40μmol／L 处的细胞活力分别为53.96%和6.98%，48h 为24.38%和4.74%，呈明显时间效应关系（P＜0.05）。

图1 β－桐酸抑制T24细胞生长的时间和剂量相关性Fig.1 Time－and－dose dependent effects of β－eleostearic acid on T24cells

如图2所示，与对照组相比，β－桐酸和α－亚麻酸处理T24细胞24h后，细胞活力均明显降低，且在一定浓度范围内呈剂量依赖性，表明β－桐酸和α－亚麻酸对T24 细胞生长均有抑制作用。但在相同浓度下，β－桐酸对T24细胞生长的抑制作用强于α－亚麻酸（P＜0.05）。

2.2 β－桐酸对细胞内ROS的影响

细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF 的荧光就可以检测出细胞内活性氧的水平。结果如图3 所示，β－桐酸处理T24细胞24、48h后，细胞内ROS的水平显著提高。同时加入ROS清除剂N－乙酰半胱氨酸（NAC），则可以拮抗β－桐酸的作用，降低ROS水平（P＜0.05）。

图2 β－桐酸和α－亚麻酸对T24细胞生长的影响Fig.2 Effect ofβ－eleostearic acid andα－linolenic acid on T24cells growth

图3 T24细胞内活性氧的变化Fig.3 Changes of intracellular ROS level of T24cells

2.3 ROS清除剂NAC对β－桐酸的拮抗作用

为了进一步检测ROS在β－桐酸抑制细胞生长中的作用，用MTT 法检测了ROS 清除剂NAC 对细胞生长的影响，结果如图4 所示。NAC 单独处理对细胞活力没有影响，加入20μmol／Lβ－桐酸显著抑制细胞生长，两者协同作用，NAC则可以拮抗β－桐酸对T24 细胞的抑制作用。表明ROS参与了β－桐酸对T24细胞生长的抑制作用（P＜0.05）。

图4 加入NAC后对T24细胞活力的影响Fig.4 Effect of NAC on T24cells activity treated by β－eleostearic acid

2.4 β－桐酸处理后细胞内GSH 质量分数的变化

GSH 质量分数是细胞内氧化还原水平的标志。如图5所示，T24细胞经20μmol／Lβ－桐酸处理24h后，细胞内总GSH 质量分数明显下降，为65.73%（P＜0.05）。加入NAC 后，β－桐酸消耗细胞内GSH 的作用明显抑制，细胞内总GSH质量分数为97.52%。

图5 β－桐酸对细胞内氧化还原水平的影响Fig.5 Effect ofβ－eleostearic acid on cellular redox level

3 讨 论

MTT 检测结果表明，β－桐酸可以抑制膀胱癌T24细胞活力，且呈现时间与剂量相关性。且β－桐酸处理T24细胞后，细胞内ROS水平显著下降，提示β－桐酸可能通过诱导ROS的积累抑制细胞生长。加入ROS清除剂NAC 检测细胞活力，发现NAC 可以拮抗β－桐酸的作用，表明β－桐酸对T24细胞的生长抑制作用是通过ROS的产生介导的。GSH 是一种重要的细胞内自由基清除剂，细胞内氧化还原水平很大程度上取决于GSH的质量分数。通过测定T24细胞内GSH 质量分数表明，β－桐酸可以通过诱导ROS 的产生，改变细胞内GSH 质量分数，从而改变细胞氧化还原水平。β－桐酸抑制细胞生长是通过诱导坏死还是凋亡还需进一步的研究，从而为进一步预防和治疗肿瘤提供新的靶点。

［1］TANAKA T，HOSOKAWA M，YASUI Y，et al.Cancer chemopreventive ability of conjugated linolenic acids［J］.International Journal of Molecular Sciences，2011，12（11）：7495－7509.

［2］张根旺.油脂化学［M］.北京：中国财政经济出版社，2000：19－21.

［3］IGARASHI M，MIYAZAWA T.Newly recognized cytotoxic effect of conjugated trienoic fatty acids on cultured human tumor cells［J］.Cancer Letters，2000，148（2）：173－179.

［4］YASUI Y，HOSOKAWA M，KOHNO H，et al.Growth inhibition and apoptosis induction by alltrans－conjugated linolenic acids on human colon cancer cells［J］.Anticancer Research，2006，26（3A）：1855－1860.

［5］HENNESSY A A，ROSS R P，DEVERY R，et al.The health promoting properties of the conjugated isomers of alpha－linolenic acid［J］.Lipids，2011，46（2）：105－119.