调节性树突状细胞的获取途径及其诱导免疫耐受的临床应用

李颖曦 陈 丹 李克秋 李 光△

树突状细胞（DCs）是体内作用最强的抗原提呈细胞，属于异质性细胞群体，其具有双向免疫调节功能，既可提呈抗原、激活T细胞，诱导免疫应答，又可使T细胞清除或促进调节性T细胞增殖，诱导免疫耐受。调节性树突状细胞（DCreg）具有负向免疫调节功能，可降低T细胞的免疫活性，诱导免疫耐受。该细胞群可抑制共刺激分子（CD40、CD80、CD86等）的表达以及白细胞介素（IL）-12的产生，增强IL-10的分泌。DCreg诱导免疫耐受的机制主要有以下几点：（1）DCreg表面缺乏主要组织相容性复合物Ⅱ类分子（MHCⅡ分子）和共刺激分子。（2）可诱导调节性T细胞增殖。（3）通过分泌具有负向免疫调节作用的物质介导免疫耐受。此外，DCreg诱导的免疫耐受作用可应用于临床治疗，如器官移植、自身免疫性疾病等。本文就DCreg的获取途径及其诱导免疫耐受的临床应用综述如下。

1 DCreg的获取途径

1.1 经药物产生 DCs具有双向免疫调节功能，可作为免疫应答中药物作用的理想靶点，广泛应用于临床治疗。可诱导产生DCreg的药物包括免疫抑制剂[雷帕霉素（RAPA）、他克莫司等]、阿司匹林、维生素（Vit）D3等。RAPA作为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的抑制剂，可与细胞内免疫亲和蛋白FK506结合蛋白（FKBP12）结合，形成RAPA-FKBP12复合物，此复合物可阻断mTOR通路，抑制DCs成熟并降低T细胞的免疫活性，从而诱导免疫耐受[1]。其具体表现为RAPA通过降低MHCⅡ分子、共刺激分子以及IL-12p40的表达，诱导产生DCreg。实验表明，当fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）结合低剂量RAPA时，可使T细胞呈低反应性，并促进调节性T细胞增殖，诱导产生DCreg和CD25+Foxp3+调节性T细胞，提示RAPA可降低T细胞的免疫活性[2]。

1.2 经细胞因子产生 几种具有免疫抑制作用的可溶性因子，如IL-10、转化生长因子β（TGFβ)、前列腺素E2（PGE2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等可诱导产生DCreg。实验表明，经IL-10处理的DCs可抑制MHCⅡ和CD86等免疫刺激分子的表达上调[3]。且Boks等[4]通过比较可产生DCreg的不同细胞因子，发现经IL-10处理的DCs具有较强的耐受性表型，可应用于临床。TGFβ也可诱导产生DCreg，在稳态下，CD8+DCs能依赖自分泌的TGFβ和吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）维持免疫耐受，而CD8-DCs不能自分泌TGFβ，但体外给予TGFβ可诱导IDO将免疫原性DCs转变为DCreg；且当阻断TGFβ受体信号时，可引起严重的自身免疫性脑炎，提示TGFβ在维持免疫耐受中具有重要意义[5]。某些细胞因子既有免疫刺激作用，又有免疫耐受作用，如急性炎症中，PGE2广泛表达于上皮细胞、成纤维细胞以及炎性细胞[6]。而慢性炎症中，PGE2可将DCs从刺激表型转化为调节表型，诱导产生DCreg。此外，多种细胞因子联合也可产生DCreg[7]，例如将成熟DCs培养在高浓度肿瘤坏死因子α（TNFα）和PGE2的肿瘤微环境中，可激活IDO的酶活性，诱导产生DCreg，维持免疫耐受作用。

1.3 经局部微环境产生 DCs具有不同亚型，在其分化为DCreg的过程中，局部微环境起到重要的作用[8]。基因转录分析表明，基质细胞群自身具有异质性[9]，因而不同来源的基质细胞诱导DCreg分化的过程也具有异质性。如脾基质细胞通过纤连蛋白与成熟DCs接触，促使DCs向DCreg的表型分化；而肾基质细胞无需细胞间的接触即可产生DCreg。Zhang等[10]报道，间充质干细胞可诱导产生CD11c+MHCⅡhiCD80loCD86loDCreg，该细胞群可通过分泌TGFβ诱导调节性T细胞分化。此外，肿瘤微环境也可分泌抑制性的可溶性因子，并持续表达与免疫抑制相关的基因，诱导产生DCreg。

2 DCreg的临床应用

2.1 器官移植 目前，器官移植已成为器官功能衰竭患者的主要治疗手段，能否有效抑制移植排斥反应是决定器官移植成败的关键。尽管临床普遍应用免疫抑制剂，但其仅能改善短期移植物存活率。且免疫抑制剂可增加感染的概率，具有不良反应，价格昂贵，需终生用药。因此，器官移植的最终目标是在受者少服用或不服用免疫抑制剂的前提下，通过实现免疫耐受使受者长期接受移植物。

诱导免疫耐受在器官移植中具有重要作用，其策略包括体内DCs的靶向治疗、体外产生DCreg以及后续的细胞治疗。研究表明，DCreg的细胞治疗可抑制移植排斥反应，并降低机体对免疫抑制剂的依赖性[11]。

2.1.1 DCreg的获取来源 获取来源不同的DCreg可产生不同的治疗效果。应用供体DCreg疗法时，许多因素易使供体致敏。另有实验表明，给予鼠输注供体DCreg后，可降低鼠的存活率，因为输注的供体DCreg无法直接调节受者体内的免疫应答[12]，它只能通过受鼠的内源性经典型DCs介导其对T细胞的抑制作用[13]，而输注自体DCreg可降低这种风险。Giannoukakis等[14]报道，将GM-CSF和IL-4诱导产生的自体DCreg输注到患者体内时，既无毒性反应又无不良反应，提示自体DCreg具有安全性。

自体DCreg还具有有效性，其表现为经静脉途径输注的自体DCreg可积聚于脾脏，捕获并处理供体抗原[15]，诱导抗原特异性器官移植免疫耐受。而供体DCreg需经脂多糖（LPS）和其他细胞因子充分刺激后才可迁移到淋巴器官，诱导免疫耐受[7]，且为了避免DCs成熟，还需用地塞米松、IL-10等修饰供体DCreg。自体DCreg无需细胞因子激活即可有效抑制DCs成熟，证实自体DCreg优于供体DCreg。

2.1.2 DCreg的输注途径 输注途径可影响DCreg诱导免疫耐受的效果。静脉输注经地塞米松处理的骨髓来源的DCs，可延长心脏移植物的存活时间，而经皮下输注的同等DCs却不能提高移植物的存活率[16]。Hirano等[17]发现，在海绵体同种异体移植模型中，经静脉输注的DCreg可诱导供体T细胞呈特异低反应性，而经直接输注途径则不能产生此效果。

2.1.3 DCreg与免疫抑制剂联用 在异体心脏移植模型中，仅注射供体DCreg不能有效地延迟移植物的排斥时间，而注射他克莫司联合供体DCreg可显著延长移植物的存活时间。此外，免疫抑制剂可增强DCs的负向免疫调节功能，特别是经他克莫司处理的鼠骨髓来源的DCs，可降低其提呈或处理抗原的能力，从而更有效地诱导免疫耐受。

目前虽鲜有DCreg应用于器官移植的临床试验报道，但很多与临床相关的灵长类动物实验证实了该应用的安全性和有效性[18-19]。Ezzelarab等[18]在肾移植术前7 d给予猕猴静脉输注DCreg和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4Ig），CTLA4Ig需持续给药至术后第8周，RAPA需持续给药6个月，发现该DCreg可降低MHCⅡ分子和共刺激分子的表达并抑制DCs成熟。其次，输注的DCreg能显著延长移植物的存活时间，且无不良反应。此外，同种异体抗原未引起宿主的致敏反应，表明DCreg在器官移植排斥反应中具有治疗作用。

2.2 自身免疫性疾病

2.2.1 1型糖尿病 Giannoukakis等[14]在1型糖尿病患者中进行了DCreg的首例临床试验。试验组患者给予皮下输注经反义寡核苷酸（以CD40、CD80、CD86为靶基因）处理的DCreg，每2周1次；对照组用同样方法给予未处理的DCs。持续监测患者体征12个月，患者体内未产生自身抗体且无不良反应，提示自体DCreg具有良好的耐受性，且患者外周血中增加的B220+CD11c-B细胞群可缓解1型糖尿病症状。此外，产生的DCreg可促使非肥胖糖尿病小鼠T细胞凋亡，逆转自身免疫性糖尿病[20]。以上研究证实了DCreg的耐受性和安全性，但其疗效仍需进一步探索。

2.2.2 类风湿关节炎 DCs是维持类风湿关节炎（RA）炎症以及导致骨和关节损害的主要参与者。其主要表现为炎性刺激物可激活DCs并侵袭滑膜液，导致骨和关节受损。此外，RA患者体内的DCs可活化B细胞产生抗体，诱发炎症。因此将高度活化的DCs诱导为可抑制自身反应性T细胞的DCreg，重建T细胞耐受，是治疗RA的新型策略。且经此治疗后，外周血中可见大量表达IDO的浆细胞样DCs（pDCs），该DCreg能把初始T细胞转变为分泌IL-10的调节性T细胞。另一种治疗方法是用小RNA干扰技术破坏DCs和T细胞之间共刺激的相互作用，该方法产生的DCs可使IL-2、γ干扰素（IFNγ）、TNFα和IL-17的表达下调，从而诱导产生Foxp3+调节性T细胞，减少RA导致的骨和关节损害[21]。

Thomas等[22]在RA的临床试验中给予患者皮下输注经BAY 11-7082（NF-κB信号通路的抑制剂）诱导产生的自体DCreg，该DCreg低表达CD40，高表达CD86，表明负载自身抗原的DCreg具有良好的耐受性且不易产生不良反应。与前者临床试验不同，Hilkens等[23]选择经关节腔输注自体DCreg，并定期监测患者外周血和关节液中对衡量DCreg疗效具有重要意义的分子标志物，发现经关节腔输注的自体DCreg具有良好的耐受性和安全性。

近年来，DCreg诱导的免疫耐受作用备受关注，且在器官移植排斥反应和自身免疫性疾病中具有潜在的治疗前景。但DCreg的细胞治疗涉及到输注剂量、输注时机、输注时间以及输注后的长短期效应等多方面问题，需进一步探索。且各种自身免疫性疾病的发病机制不尽相同，这给DCreg治疗自身免疫性疾病带来了困难。因此合理利用并选择合适的获取途径是将DCreg成功应用于临床治疗的关键。

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