STIM 2、TRPC3在人脐静脉内皮细胞外钙敏感受体介导的钙内流和NO生成中的作用*

王 静，钟 华，赵 慧，王腊梅，庞丽娟，孙志萍，何 芳△

近年来，围绕钙通道蛋白在不同组织细胞中经钙池操纵的钙离子通道（store-operates cation channels，SOC）介导的生理和病理生理作用展开了大量研究。在哺乳动物中，Ca2＋感受蛋白基质相互作用分子（stromal interactionmolecule，STIM）有两种蛋白：STIM1和STIM2。研究发现STIM1为钙库操纵的钙内流（store operated calcium entry，SOCE）必不可少的调节蛋白。而STIM2是STIM1的同系物，STIM2与STIM1分享全部蛋白质结构域并与STIM1组成异型多聚体［1］，在基础状态下，STIM2在维持及调节细胞内钙离子浓度（intracellular Ca2＋concentration，［Ca2＋］i）的过程中起重要作用。C型瞬时型感受器电位（transient receptor potential canonical，TRPC）超家族中共有7个成员（TRPC1 7），他们均表达于内皮细胞。TRPC3作为其中的一种亚型，可参与多种疾病病理生理过程。在人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）由 TRPC1／TRPC3异源二聚体构成 SOC［2］。

钙敏感受体（Ca-sensing receptor，CaR）为G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptor，GPCR）超家族中C亚族的成员。在HUVEC中，CaR可经SOC发挥介导 Ca2＋内流和 NO生成的作用［3-4］，且 TRPC1和STIM1为参与上述过程的关键组件之一（文章已整理投稿），那么 STIM2、TRPC3是否参与CaR介导的Ca2＋内流和NO生成？本研究拟在前期工作基础上以原代培养的HUVEC为研究对象，构建STIM2和TRPC3RNA干扰质粒，并观察STIM2和TRPC3基因沉默，HUVEC中［Ca2＋］i和 NO生成的变化，以证明STIM2和TRPC3在 CaR介导的［Ca2＋］i和 NO生成中的作用，为心脑血管疾病的防治提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

健康孕妇剖宫产的新鲜脐带（来自华中科技大学同济医学院附属同济医院，经伦理道德委员会批准和个人知情同意）。

1.2 主要试剂

ECM培养基（Sciencell）；蛋白酶抑制剂（Calbichem）；兔抗人TRPC3多克隆抗体、鼠抗β-Actin单克隆抗体（Santa Cruze）；鼠抗人 STIM2多克隆抗体（Cell signaling）；二抗（Protein Tech）；ECL发光试剂盒（Thermo）；逆转录试剂盒与Real time RT-PCR试剂盒（TaKaRa）；LipofectamineTM2000与 Opti-MEM（Invitrogen）；Fura-2／AM（Invitrogen）；DAF-FM DA（NO荧光探针）（Beyotime）；G418（Biosharp）、去内毒素高纯度质粒抽提试剂盒（Omega）；shRNA（上海吉凯基因化学技术有限公司）；引物（友名生物技术有限公司）；其余均为国产分析纯试剂。

1.3 主要方法

1.3.1 HUVEC的培养与鉴定 依据本研究室以前的方法培养 HUVEC并传代［3］，用细胞内Ⅷ因子相关抗原进行免疫细胞化学染色，鉴定HUVEC，取生长状态良好的2～5代细胞用于实验。

1.3.2 免疫荧光检测HUVEC中STIM2与TRPC3的蛋白表达 将细胞接种在玻片上，孵育24 h，用PBS溶液冲洗细胞三次，冰甲醇固定。含0.2%Triton的PBS冲洗细胞两次，0.5%Triton加入细胞中，室温下破膜15min后用含0.2%Triton的 PBS洗5 min，5%BSA封闭40min。保持细胞湿度，加一抗，4℃冰箱中孵育。第二天加入二抗，避光孵育细胞1 h，0.2%Triton的 PBS洗 5 min后加核染料 DAPI（1：1 000）室温避光孵育 15 min，含 0.2%Triton的 PBS洗5min，荧光显微镜观察并记录结果。

1.3.3 TRPC3、STIM2基因的 shRNA构建及转染（1）根据shRNA的设计原则，GenBank中人TRPC3的cDNA序列（NM-003305）、人 STIM2的 cDNA序号（NM-020860），分别以其同源的编码DNA序列部分设计、合成3条shRNA。上述序列经BLAST软件分析，与人类基因外显子无同源性，排除对其他基因非特异性干扰，并与载体连接构建成重组质粒。（2）转染：细胞生长至70%～90%时进行转染，实验分为未转染组即空白对照组（control组）、空质粒组（vehicle组）和特异性质粒转染组即实验组（TRPC3shRNA和STIM2shRNA组）。以六孔板的一个孔为例，首先取一无菌EP管加250μl OPTI-MEM培养基和5μl LipofectamineTM2000，轻轻混匀。在取另一无菌EP管加250μl OPTI-MEM培养基和2μg质粒DNA，轻轻混匀。室温下孵育5 min后，混匀以上两种复合物，室温孵育20 min。最后将此复合物加入到含有1.5ml OPTI-MEM的六孔板中，细胞培养4～6 h后，换无血清ECM培养基继续培养。瞬时转染24～48 h后，加入 G418（200μg／ml）进行筛选，待未表达抗性基因的细胞被杀死后，将G418浓度改为100μg／ml维持一周。

1.3.4 Real time RT-PCR检测 HUVEC中 TRPC3 mRNA及STIM2mRNA的表达 引物由友名生物技术有限公司设计合成。STIM2的上游引物是5’-TCA GTA TGCAGA ACA GGA ATTGGA A-3′，下游引物是5’-GAA GTG CAT CTG GAA CAG ACC AAC-3’。TRPC3的上游引物是5’-CAT TCT CAA TCA GCC AAC ACG TTA T-3’，下游引物是 5’-CTC AGT TGC TTG GCTCTT GTC TTC-3’。用 Trizol法抽提细胞 RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。然后按逆转录试剂盒与real time RT-PCR试剂盒对mRNA进行逆转录与多聚酶联反应，反应体系为25 μl，其中 SYBR Premix Ex Tap 12.5μl，PCR Forward Primer 0.5μl，PCR Reverse Primer 0.5μl，样品 cDNA 2.0μl，灭菌蒸馏水 9.5μl。反应条件为预变性95℃，30 s；PCR反应（95℃ for 5 s、60℃ for 20 s），40个循环。

1.3.5 免疫印迹法检测HUVEC中TRPC3、STIM2的蛋白表达及干扰效率 各转染组转染48 h后，用G418进行稳筛，弃去培养基，用预冷的PBS冲洗细胞3次，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液（1∶100），提取细胞总蛋白，BCA试剂测定蛋白含量。SDS-PAGE电泳分离蛋白，选用硝酸纤维素膜（nitrocellulose，NC膜）进行湿转，用5%脱脂奶粉TBST溶液封闭 1 h，分别加入 TRPC3（1∶200）和 STIM2（1∶5 000）一抗，4℃冰箱中孵育。第二天 TBST洗膜四次，加入二抗（1∶5 000），37℃摇床上孵育 1 h。TBST洗膜3次。用ECL化学发光试剂进行显色，显影、定影，获得实验结果。

1.3.6 HUVEC中 Ca2＋浓度测定 参照文献［5］将第2代或第3代HUVEC接种到圆形玻片上。当细胞密度达80%时给细胞转染，转染48 h后将玻片取出放入自制的灌流槽中，将1μl浓度为1mmol／L的Fura-2／AM与499μl含2mmol／L含钙液混合后加入灌流槽中，37℃孵育细胞30 min。冲洗3～5遍后用含钙液去酯化30min。将灌流槽放于倒置荧光显微镜上，利用340 nm与380 nm波长的激发光激发Ca2＋荧光探针Fura-2／AM发射荧光，用 CCD拍摄荧光的动态变化，通过340 nm和380 nm的荧光强度比值的变化（即Δratio）反映［Ca2＋］i。

1.3.7 HUVEC中 NO含量的检测 参照文献［5］，将第2代或第3代HUVEC接种于放有圆形玻片的培养皿中，待细胞达80%左右融合时进行转染，转染48 h后将玻片取出放入自制的灌流槽中，按1∶2 000比例加入DAF-FM DA荧光探针稀释液稀释DAF-FM DA，37℃孵育细胞 20 min后，用 2 mmol／L含钙液冲洗3次后将灌流槽放于荧光显微镜上，用495 nm激发波长，515 nm发射波长，实时检测刺激前后荧光的强弱，并通过 IPA Software进行分析。NO含量＝（测定孔曲线最高相对荧光强度（relative fluorescence unit，RFU），-最低 RFU）-（空白孔曲线最高 RFU-最低 RFU）。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 免疫荧光检测HUVEC中STIM 2与TRPC3的蛋白表达

在共聚焦荧光显微镜下观察转染细胞，细胞核的DNA染料（DAPI）阳性着色显示为蓝色荧光，TRPC3的阳性着为绿色荧光，STIM2的阳性着色为红色荧光，可见HUVEC中STIM2和TRPC3蛋白表达呈阳性，且两者均主要定位于胞浆（图1见彩图页Ⅰ）。

2.2 激光共聚焦显微镜下观察shRNA成功转染HUVEC

细胞转染Cy3标记的shSTIM2后，激光共聚焦显微镜下观察可见成功转染的细胞发出红色荧光，可反映转染效率。转染48 h后加入G418稳筛后，可获取90%以上的阳性克隆细胞（图2见彩图页Ⅰ）。

细胞转染FITC标记的shTRPC3后，激光共聚焦显微镜下观察可见成功转染的细胞内发出绿色荧光，可反映转染效率。转染48 h后加入G418稳筛后，可获取90%以上的阳性克隆细胞（图2见彩图页 Ⅰ）。

2.3 Real time RT-PCR检测 HUVEC中 STIM 2 mRNA和TRPC3mRNA的表达及干扰效率

同一代HUVEC分为5组：即空白对照组（Control组）、空质粒组（Vehicle组）和实验组（shSTIM2-001、shSTIM2-002、shSTIM2-003 组；shTRPC3-003、shTRPC3-004、shTRPC3-005组）。各转染组分别转染48 h后用G418进行稳筛后提取总mRNA，采用Real time RT-PCR检测STIM2mRNA和TRPC3mRNA的表达。结果显示：转染各组与Control组相比，可见vehicle组mRNA表达无明显变化（P＞0.05），其余各转染组mRNA的表达均有降低，尤其是shSTIM2-002组中STIM2mRNA表达显著降低（抑制率为88.2%（P＜0.05）、shTRPC3-004组中 TRPC3mRNA表达也是显著降低（抑制率为 74%，P＜0.05，图 3A，图3B）。

Fig.3 Interference ratio ofmRNA after transfection in HUVEC（¯x±s.n＝3）A：STTIM2 mRNA inhibition ratio（%）；B：TRPC3 mRNA inhibition ratio（%）*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs vehicle group

2.4 免疫印迹技术检测STIM 2和TRPC3的蛋白表达及干扰效率

提取转染 48 h、用 G418（200mg／L）进行筛选 7 d后HUVEC总蛋白，转染各组与Control组相比，可见vehicle组的蛋白表达无明显变化（P＞0.05），其余各转染组蛋白的表达均有降低，尤其是shSTIM2-002组中STIM2的蛋白表达显著降低（抑制率为79.9%（P＜0.05）、shTRPC3-004组中 TRPC3的蛋白表达也是显著降低（抑制率为 71.7%，P＜0.05，图 4）。

Fig.4 Expression of the protein examined by Western blot and their inhibition ratio in HUVEC（¯x±s¯x，n＝3）A：The expression of the STIM2 protein and its inhibition ratio；B：The expression of the TRPC3 protein and its inhibition ratio*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs vehicle group

2.5 在精胺刺激下各转染组HUVEC内［Ca2＋］i和NO生成的变化

选取干扰效率最高的ShSTIM2-002和ShTRPC3-004组为实验组（即精胺＋Ca2＋＋ShSTIM2-002组和精胺＋Ca2＋＋ShTRPC3-004组），其余两组分别为空白对照组（Control组，即精胺 ＋Ca2＋组），空质粒组（Vehicle组，即精胺 ＋Ca2＋＋Vehicle组），将四组细胞接种于圆形玻片上，待HUVEC生长融合至80%左右时进行转染，继续培养48 h后将玻片取出放入灌流槽中测定［Ca2＋］i△ratio值和NO荧光强度值的变化，与精胺＋Ca2＋及精胺＋Ca2＋＋Vehicle组相比，精胺 ＋Ca2＋＋ShSTIM2-002组及精胺 ＋Ca2＋＋ShTRPC3-004组 ［Ca2＋］i△ratio值和 NO净荧光强度值均无显著差异（P＞0.05），说明 ShRNA沉默STIM2或TRPC3基因，未能使CaR介导的［Ca2＋］i和NO生成减少（图 5、6）。

Fig.5 Dynamic changes of intracellular calcium fluorescence intensity ratio after CaR agonist spermine in different transfected HUVEC

Fig.6 Dynamic changes of NO fluorescence intensity after CaR agonist spermine in different transfected HUVEC

Tab.1 Intracellular calcium fluorescence intensity ratio and dynamic changes of net NO fluorescence intensity after CaR agonist spermine in different transfected HUVEC（¯x±¯sx，n＝3）

3 讨论

作为细胞内的第二信使，Ca2＋在信息的传递，生命过程的调控中起着非常重要的作用［5］。研究证实血管内皮细胞持续的外Ca2＋内流是NO释放的必须条件，体内外实验研究也表明细胞外Ca2＋可调节NO生成。可见，在NO生成过程中［Ca2＋］i变化起着举足轻重的作用。CaR属于GPCRC家族的II型受体，CaR可通过介导内Ca2＋释放和Ca2＋内流调控［Ca2＋］i，当CaR被激活，通过细胞内的三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-trisphosphate，IP3）受体途径可引起Ca2＋库耗竭（即内 Ca2＋释放），使 SOC激活，引发外Ca2＋内流使［Ca2＋］i升高［6］。以往研究大多只关注细胞内钙释放对［Ca2＋］i及 NO生成的影响［7］，而细胞内钙池持续释放有赖于外Ca2＋内流对细胞内钙池的重新填充［8］，且本课题组前期研究发现在HUVEC中CaR激活引发持续Ca2＋内流是NO生成重要条件［3-4］，但参与Ca2＋内流关键分子组件尚不清楚。

STIM作为内质网（endoplasmic reticulum，ER）上的Ca2＋感受器，存在有2个亚型：STIM1和 STIM2，表达在不同类型的细胞中。在猪的主动脉内皮细胞研究发现STIM1在凝血酶经蛋白水解酶-激活受体-1介导SOC及依赖SOC的NO生成过程中起着重要作用［9］，在人的成肌细胞分化及肌管兴奋-收缩偶联过程中STIM2是STIM1必须的伴侣蛋白，STIM1通过与STIM2相互作用介导 SOC活化［10］。与 STIM1要在ER内Ca2＋几乎完全耗竭才被激活不同，STIM2可以感受ER中Ca2＋浓度较小程度的变化，当Ca2＋库部分排空而STIM1未被激活时，STIM2被激活从而维持SOC的开放［11］。TRPCs包括7个亚型。其中TRPC1可与C1或TRPC亚家族中其它亚基以同源二聚体或异源二聚体及多聚体形式构成不同的SOC，发挥不同的生理和病理生理作用。TRPC3作为其中的一种亚型，可参与多种疾病病理生理过程。Reading等［12］研究发现抑制TRPC3的表达可减少细胞去极化作用，该作用主要是通过抑制三磷酸尿苷（uridine triphosphate，UTP）激活的阳离子内流，从而抑制了UTP所介导的血管平滑肌收缩，因此，TRPC3有促进阳离子流通和促收缩作用。

本课题组前期的研究显示，在HUVEC中有CaR的表达，并通过使用CaR激动剂Spermine和负性变构调节剂Calhex231及CaR干扰技术，证实了在HUVEC中CaR激活后经 SOC参与了 ［Ca2＋］i升高及NO生成［3，4，13］，但 STIM2及 TRPC3是否为 CaR介导Ca2＋和NO生成的分子组件目前还有待研究。作为一种高效、快速、特异的基因阻断技术，RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术近年来被广泛使用，它能通过正、反义 RNA片段形成双链 RNA，由双链RNA特异性地引起同源靶基因mRNA降解，使其基因表达受到抑制［14］。那么在 HUVEC中分别沉默STIM2及 TRPC3基因，CaR介导的［Ca2＋］i和 NO的生成会有什么变化呢？本研究首先用免疫荧光细胞化学技术检测发现STIM2和TRPC3两者在HUVEC中均有表达。然后采用脂质体法将设计好的shRNA包裹转染到HUVEC中，并使用Cy3和FITC标记的shRNA，转染48 h后用G418进行稳筛后，在荧光显微镜下可以看到80%的细胞都发出绿色或红色荧光。对转染后STIM2和TRPC3的蛋白和mRNA表达定量分析结果表明沉默STIM2和TRPC3基因可有效抑制 STIM2和 TRPC3的蛋白和 mRNA表达。在此基础上，本研究以激动剂Spermine作为配体激活CaR，在细胞外有钙的情况下，STIM2和TRPC3基因沉默组HUVEC中［Ca2＋］i与对照组相比没有明显的变化。已知Ca2＋是激活eNOS生成NO的重要辅助因子，那么沉默STIM2和TRPC3基因是否会对NO生成产生影响呢？进一步的结果显示，无论是沉默STIM2基因还是沉默TRPC3基因都未影响NO的生成。

综上所述，本实验通过RNAi沉默 HUVEC中STIM2和 TRPC3的表达，成功构建了 shSTIM2和shTRPC3，为后续相关STIM2和TRPC3基因功能的研究打下了基础，并进一步证实了STIM2和TRPC3并非CaR介导的钙内流和NO生成的关键组件。目前尚未有关于STIMs和TRPCs在其他组织细胞中介导钙活动及其相关功能的报道，深入研究STIMs和TRPCs的功能，除了会对深入了解血管生理和病理生理产生重要意义，更会为今后进一步从调节［Ca2＋］i相关蛋白角度探讨心血管疾病的发病机制和防治措施提供新的思路和靶点。

衷心感谢华中科技大学同济医学院病理生理学系／卫生部呼吸疾病重点实验室提供实验条件和技术指导。

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