莱姆病螺旋体检测技术的进展

郑 旭，王玮琳，丁 旭，乔 萍*，刘 阳*

(1.吉林大学 基础医学院药理系,吉林 长春130021；2.吉林出入境检验检验局，吉林 长春130062)

1 莱姆病螺旋体简介

莱姆病(Lyme Disease，LD)最早发现于美国的Lyme镇并由此得名，莱姆病是由蜱传播的一种自然疫源性、人畜共患疾病，通过肩突硬蜱感染人体宿主，可引起多系统器官损害，游走性红斑、神经炎、关节炎、心肌炎等。1982年Burgdorfer W等人成功从肩突硬蜱(Ixodes ricinus)中分离出莱姆病病原体——螺旋体[1]，螺旋体感染通常是开始于肩突硬蜱幼虫阶段,主要以哺乳动物为宿主，积聚于宿主中肠。十九世纪末美国CDC已报道病例200 000多例，二十世纪初也有数万件病例。莱姆病分布较广泛，全球70多个国家都有该病发生，我国已有30多个省市发生该病。

1984年螺旋体被正式命名为伯氏疏螺旋体[2]，属于原核生物界螺旋体目螺旋体科疏螺旋体属的一种,是一种单细胞疏松盘绕的左旋螺旋体,菌体长20-30 μm，宽0.2-0.3 μm。蜱传播的疏螺旋体属包含约40个种属，通过不同的宿主相互作用和携带病原体的载体特异性，将螺旋菌分2个主群：回归热(RF)螺旋体和复杂狭义伯氏疏螺旋体。RF螺旋体通过“软蜱”传染，复杂狭义伯氏疏螺旋体通过“硬蜱” 引起莱姆病。宿主和载体的特异性可以更容易的区分RF和伯氏疏螺旋体。

伯氏疏螺旋体在细菌中是最复杂的一个，基因组包含950 kb线性染色体、范围在9-62 kb，由不同的线性质粒和环形质粒组成，线性扩增子有共价闭合端粒，扩增子需要端粒解离酶ResT，基因组有很低的G+C，含量大约在28%左右。大约5%的螺旋体染色体和15%质粒基因编码130多个脂质蛋白。螺旋体的外膜蛋白(outer surface proteins,Osp)大多是脂质蛋白，已被报道的OspA、OspB、OspC、OspD、OspE和 OspF等。其中具有抗原性的是OspA、OspC和 OspF。许多文献都研究过外膜蛋白，针对这些蛋白的抗原性采用相

应抗体进行检测，其中应用多克隆抗体检测结合蛋白质印迹法(Western blot )，以区分不同的致病病原体抗原，但至今仍然没有一个准确的抗原Marker，确定抗原Marker可以更好更快的检测。外膜蛋白可以在莱姆病不同的发病阶段被检测，但每个阶段如何检测没有统一的标准。许多学者也一直致力于这方面的研究。

伯氏疏螺旋体有数十几种基因型：B.buredorferi sensu stricto、B.garinii、B.afzelii、B.japanica、B.valaisiana、B.1usitaniae、B.andersonii、B.tanulkii、B.turdi、B.bissetii、.B.hermsii、B.sinica、B.bavariensis sp.nov、B.spielmanii、 B.valaisiana 、B.yangtze sp.nov.等。其中，B.burgdorferi ss、B.afzelii、 B.bissettii、B.garinii、B.lusitaniae和B.bavariensis sp.nov.主要流行于欧洲中部，在美国B.burgdorferi ss是主要的病原体，我国病原体则以B.garinii为主，其次为B.afzelii 和B.burgdorferi ss。其中有四种基因型有致病性即狭义伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi sensus stricto)、伽氏疏螺旋体(B．garinii)、阿氏疏螺旋体(B．Afzelii)、B.spielmanii，其余的潜在病原体仍然不是很清晰。然而，在临床病人体中存在的B.bissettii、B.lusitaniae和B.valaisiana也有迹象可能引起莱姆病[3-4]。

为了满足实验诊断，许多新的检测方法被应用，如应用酶联反应检测特异性抗体、重组抗原、表位抗原；应用分子生物学方法进行检测，如PCR、荧光定量PCR及联合应用RFLP、LAMP等。本文对莱姆病螺旋体的检测方法进行综述，以期能够为将来的研究提供帮助。

2 直接检测

最初实验室的诊断是分离菌体，螺旋体通过BSK完全培养基进行培养，在生长14天后可在暗视野相差显微镜下观察其形态，虽然现在的实验试剂都已经商品化，大大缩短了原有的培养基准备和配置时间，但仍无法做到快速检测，所以培养菌体不是我们进行检测的主要手段。

3 免疫学技术检测

莱姆病常常在感染初期阶段被诊断，而游走性红斑(EM)常作为临床的诊断标准。但EM只在一部分病例中出现，大约40%的游走性红斑患者血清呈阴性，也有感染后持续很多年才在健康人群中发现血清呈阳性。因此，不能作为确诊的唯一标准。有些病人可能有非典型皮损，或没有皮肤症状，但实验室检测结果阳性时也可诊断为莱姆病螺旋体感染。这些检测通常旨在检测特异的IgM 或IgG 抗螺旋体抗体。

最早的检测方法是应用间接免疫荧光检测IIFA。ELISA也广泛应用于辅助诊断，但不能准确分辨莱姆病的致病基因型，同时也会出现假阳性的结果，其灵敏性低。按照欧洲标准，在两个阶段进行血清学诊断，第一阶段包括应用ELISA方法，检测IgM和IgG抗体水平。第二阶段应用免疫印迹法(IB)进一步检测不确定的结果。此后经过不断的对比和改良，将第一阶段的ELISA换成 IIFA再联合 IB，大大提高了实验的准确性。但这种检测也还存在一定的缺陷，选择一个合适的抗原对于血清学的检测是很重要的，如p30、p31、p39、p83、Osp17可作为重要的抗原，但抗原的检测会产生一定的交叉反应，使得检测仍无法得到十分准确的结果，感染早期OspC是最要的抗原之一，蜱在幼虫时感染螺旋体就可表达，部分学者认为OspC和VlsE抗原可以作为检测抗原。针对这些抗原除传统的一些方法，现在普遍应用的蛋白质印迹法(Western blot )结果通过特异条带表示,可以很好的区分疫苗反应产生的抗体和自然产生的抗体,所以WB的特异性较传统方法好。但因为条带局限于主观视觉可导致假阳性，抗体反应也各有不同，所以诊断标准尚不明确。

螺旋体特异性抗原即使感染了几周也不易察觉，也没有明显的感染症状，直接培养和普通PCR的诊断方法敏感性过低，近年来为了能在早期就可以检测到感染的活体病原，学者通过淋巴细胞转化实验(lym-phocyte transformation test，LTT)应用裂解液裂解抗原检测健康个体阴性血清与阳性血清，在临床上即使应用抗生素治疗LTT也可以达到很高的准确性和特异性[5]。应用(LC)-MS/MS(gel-based liquid chromatography)和(2D)-LC-MS/MS技术检测不同蛋白，在所检测的286种蛋白中，有97种在三个致病螺旋体中发现，可作为靶蛋白应用于普及性的疫苗以阻止不同种螺旋体所引起的莱姆病[6]。

随着LD血清学的发展，应用重组抗原大大提高了检测的准确性和灵敏性，除外膜蛋白A、B、C、E、F，还有FlaA,BBK32，P35，VlsE和DbpA。重组蛋白在感染的不同阶段针对IgG和IgM，大大提高了检测效率和结果的准确性，在血清学诊断中重组抗原单独应用或联合应用，与应用单独全蛋白相比减少了交叉反应。另外，也可以联合应用不同的免疫学方法检测重组抗原，如ELISA-IB可增加灵敏性。目前部分学者研究发明一种新方法免疫聚合酶链式反应(Immuno-PCR，IPCR)以感染螺旋体产生的宿主免疫应答为基础，应用重组抗原在体内表达促进免疫应答产生相应抗体进行检测[7]。IPCR是一种液相蛋白检测方法，结合了PCR的灵敏性以及免疫分析为基础的特异性和多样性,对于直接检测血液中的病原体和多宿主免疫应答抗体的检测，IPCR有潜在的可应用性[8-9]。

除上述针对IgG和IgM抗体的体外实验检测,也可通过自身的细胞免疫应答进行增殖分析，莱姆病螺旋体细胞免疫应答已被应用到外周血单核细胞或病人感染组织的细胞。螺旋体功能性抗体检测：有研究认为,莱姆病早期的血清阴性结果是形成了特异的抗原—抗体复合物,阻碍了对自由抗体的检测。抑制螺旋体抗体实验是通过螺旋体、临床病人的血清、外源性补体共同培养,观察螺旋体生长抑制进行判断。循环免疫复合物抗体的检测,首先将免疫复合物从血清中沉淀,然后裂解复合物,释放抗体,以便抗体能被ELISA或Western blot检测，这种方法适用于早期莱姆病常规检测血清呈阴性的病例，以及判定阳性血清是否假阳性。

4 分子生物技术检测

对于莱姆病螺旋体的分子生物学检测主要是PCR方法，在大多数的研究中针对不同的基因序列设计引物，如针对OspC、OspA、16SrRNA、5S-23SrRNA。在实验诊断中，PCR方法因为快速及相对简便而起到很重要的作用，各种PCR方法包括传统PCR，巢式PCR，实时定量PCR。1989年第一次应用PCR检测螺旋体,与免疫学方法相比PCR检测可以省去培养、观察及操作中的时间损耗，且更为灵敏，在不断的发展中，各种不同的PCR也日益完善。

在不同的病原体细菌中,对于诊断、流行病调查和对病原体中主要基因的追踪，分子生物学提供了强有力的方法。PCR特异性应用于体内培养困难的病原体检测同时也适用于感染螺旋体的检测,如rrs编码16SrRNA,ospA编码外膜蛋白A,flaB编码鞭毛等,以DNA为基础的多种标记物能够区分螺旋体种类。

应用于螺旋体鉴定的大部分方法，如PCR,脉冲场凝胶电泳，随机扩增DNA等,花费大量时间和经费而且人为的错误和污染也不能避免。PCR基础方法中，巢氏PCR被认为是临床检测螺旋体菌属最敏感的方法之一，以基因内部片段：flaB，5S,23S，ospA等为靶基因进行引物设计，虽然引物设计更复杂，但避免了交叉反应。同时也减少了单一PCR产物的错配、人为原因等误差，可更好的增加准确性、重复性、敏感性。

荧光定量PCR技术,融汇了PCR高灵敏性、DNA 杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点,通过直接探测PCR过程中荧光信号的变化,以获得定量的结果，使得检测更方便快捷，扩增靶基因的同时也可通过一个PCR过程检测靶基因产物，减少环境对目的基因产物的污染。很多文章报道了以荧光PCR方法检测螺旋体种属水平，螺旋体基因如hbb,p66,recA,ospA，glpQ，16S rRNA等，区分狭义螺旋体种类，扩增DNA的扩增子很容易确定解链温度，不需要以往的PCR过程。荧光PCR可快速检测临床样本、动物组织、及环境中存在的病原体。

PCR有不同的灵敏性，包含种属特异性探针的PCR相对传统PCR以及高灵敏和特异性的实时定量PCR(qPCR)更有优势，例如针对5S-23S,16S,ospA特异性序列，以TaqMan(MGB)为探针检测蜱中螺旋体病原体比TaqMan减少更多的错配。

PCR也可结合不同的检测手段进行诊断，主要有限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP) 和反向线状印迹(Reverse line blot,RLB),但是PCR结合RFLP、RLB在区分本病病原时需要复杂的系统,及专业的技术人员，费时费力,对实验操作要求较高。PCR方法用于检测伯氏疏螺旋体时，由于其基因的多态性无法有一个标准直接鉴别伯氏疏螺旋体，所以也会花费大量的鉴定时间。另一种核酸扩增方法——环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[10]用于实验检测，具有更高的灵敏性和扩增效率，LAMP可以控制酶反应的最佳温度，相比传统PCR在最后阶段很少发生扩增的抑制反应 ，较之前的方法简便，但温度的控制却很难把握。

综上所述，莱姆病的检测所应用的方法只是辅助检测手段，不能作为确诊的标准。现今，因地域不同，感染蜱传疾病的情况有所差异。同时蜱传疾病的菌种容易产生多种变异菌株，各种遗传和变异特性很难确定，不利于对莱姆病的预防和治疗的研究，目前蜱传疾病已引起许多学者的广泛关注，随着对其致病机理研究的更加透彻，其检测方法的研究也势必飞速发展。

参考文献：

[1]Burgdorfer W,Barb our AG,Hayes SF,et al.Lyme disease a tick borne spirochetes[J].Science,1982,216:1317.

[2]Baranton G,Postic D,Saint Girons I,et al.Delineation of Borrelia burgdorferi sensu stricto,Borrelia garinii sp.nov.,and group VS461 associated with Lyme borreliosis[J].Int J Syst Bacteriol,1992,42(3)：378.

[3]Collares-Pereira M,Couceiro S,Franca I,et al.First isolation of Borrelia lusitaniae from a human patient[J].Clin Microbiol,2004,42:1316.

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[9]Heikkila T,I Seppala,H Saxen,et al.Species-specific serodiagnosis of Lyme arthritis and neuroborreliosis due to Borrelia burgdorferi sensu stricto,B.afzelii,and B.garinii by using decorin binding protein A [J].Clin Microbiol,2002,40:453.

[10]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28(12):E63.