蛋白质组学技术在乳品研究中的应用

芦 晶， 刘 鹭， 张书文， 吕加平

中国农业科学院农产品加工研究所， 北京 100193

牛乳已经成为人们日常生活中获取营养的主要食品之一。牛乳中蛋白质含量为3%～4%，脂肪含量为3%～5%，乳糖含量为5% 左右，并含有丰富的矿物质及维生素。牛乳蛋白质主要分为三类：酪蛋白、乳清蛋白及乳脂肪球膜蛋白。 其中，酪蛋白约占乳总蛋白质含量的80%，乳清蛋白占18%～19%，乳脂肪球膜蛋白只占1%～2%。通过传统的蛋白质化学手段研究发现，牛乳酪蛋白主要含有αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白及κ-酪蛋白；乳清蛋白主要含有α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白及免疫球蛋白;乳脂肪球膜蛋白主要包括黄嘌呤氧化酶、嗜乳脂蛋白、脂肪分化相关蛋白和PAS 6/7[1]。由于技术水平的限制，利用传统蛋白质化学手段从乳品中鉴定出的蛋白质数量有限，限制了对乳品蛋白质营养和功能活性的利用。近年来,随着蛋白质组学技术的发展，通过该技术已发现牛乳中含有多达上百种蛋白质，包括大量免疫蛋白、乳品成分合成相关的酶类及转运蛋白、细胞形态相关蛋白质等。对蛋白质种类的鉴定及功能性质的研究将有助于提高对牛乳的认识和利用。

1 蛋白质组学技术

在过去几十年中，蛋白质组学技术从出现到发展取得了巨大的进步。蛋白质组学技术可以定性、定量分析不同样品中的蛋白质种类及性质[2]。蛋白质组学技术一般包含样品处理、质谱测定和数据分析三个步骤。

1.1 样品处理

样品处理包括从不同的样品中提取蛋白质、蛋白质前处理和蛋白质的酶解。根据蛋白质样品的性质，也可以减少或省略样品处理中蛋白质提取及前处理步骤。 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳和一维聚丙烯酰胺凝胶电泳是常用的蛋白质前处理方法。二维聚丙烯酰胺凝胶电泳是先根据蛋白质等电点将蛋白质分离，然后根据蛋白质的分子量进行二次分离，进而选取电泳胶片上的蛋白质点进行质谱分析。一维聚丙烯酰胺凝胶电泳是根据蛋白质的分子量将蛋白质进行分离，将电泳胶条的目标胶条酶解后进行质谱分析，或将胶条平均切割成几段，将不同条段进行酶解及质谱分析。如果样品中蛋白质种类不复杂，也可将蛋白质直接进行酶解测定。

通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳和一维聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质前处理较为常见，但两者均具有局限性。经过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳处理后的蛋白质样品在质谱分析中鉴定出的蛋白质种类较少，因为只有被染色的蛋白质可以进行质谱分析，许多含量较低的蛋白质在染色过程中被含量较高的蛋白质所覆盖未被检出，而低含量的蛋白质往往具有重要的生理生化作用[3～5]。另外，二维凝胶电泳很难将疏水性强的膜蛋白进行分离[6]，而对于膜蛋白的研究在生物学领域具有重要的意义。通过一维聚丙烯酰胺凝胶电泳测定出的蛋白质种类及数量较大，但是由于对凝胶条带的切割，大大增加了实验过程中的步骤和工作量。一维聚丙烯酰胺凝胶电泳不适用于对蛋白质进行定量分析[3]。

近几年，蛋白质前处理新技术不断出现。如二维液相色谱分离前处理技术和过滤器辅助样品前处理技术。二维液相色谱分离是将酶解蛋白质肽段进行二次液相色谱分离，进而达到预期的分离效果，该技术可以加大蛋白质鉴定的种类及数量[7]。 过滤器辅助样品前处理技术是利用SDS将膜蛋白进行溶解，进而通过过滤器将SDS从样品中移除，解决了凝胶电泳前处理方法对膜蛋白分离的局限性。另外，过滤器辅助样品前处理方法还减少了一维电泳中过多的操作步骤，大大降低了实验误差，可以用于蛋白质质谱定量分析[8]。

1.2 质谱测定

通常情况下，酶解蛋白质会先通过液相色谱分离肽段后进行质谱测定，确定各肽段的分子量。除了对蛋白质种类的鉴定，蛋白质的含量也逐渐成为研究的焦点。比起蛋白质种类，含量似乎更能解释生物学差异。因此利用蛋白质组学对蛋白质含量进行测定逐渐成为蛋白质组学研究中的主流。目前对于利用质谱技术对蛋白质含量测定主要分为两大类，一类是绝对蛋白质含量的测定，另一类是相对蛋白质含量的测定。绝对蛋白质含量测定是利用标准蛋白质肽段物质对特定的肽段进行定量分析，此法适用于针对个别蛋白质的定量分析。相对蛋白质含量测定是目前蛋白质组学中应用较多的方法，分为标记法和非标记法。标记法利用标记物质与蛋白质特定氨基酸的结合，利用不同标记物分子量的差异，对不同样品中的同一种蛋白质进行比较分析。 常见的标记物质有iTRAQ、SILAC、ICAT 和二甲基标记。非标记法利用质谱中蛋白质肽段图谱强度对不同样品中同一蛋白质的含量进行比较，避免了使用昂贵的标记物质，但是为得到精确的定量数据，实验往往需要大量的重复[9～11]。

1.3 数据分析

数据分析是蛋白质组学技术最重要的步骤。利用生物信息学，运用特定的算法，根据蛋白质或蛋白质酶解物肽段的分子量与蛋白质数据库进行比对，从而鉴定出样品中的蛋白质种类。目前用于蛋白质组学鉴定的软件有多种，较常用的有MaxQuant、X!Tadam和Mascot 等。

2 蛋白质组学在乳品研究中的应用

近年来,蛋白质组学技术已广泛应用于乳品中不同蛋白质组分的研究，包括酪蛋白、乳清蛋白和乳脂肪球膜蛋白。通过蛋白质组学技术发现，乳品中除了熟知的几种主要蛋白质外还含有上百种不同种类的蛋白质。 在蛋白质组学研究中，也同时讨论了这些蛋白质的功能性质。D′Alessandro等[12]将不同乳品蛋白质组学研究整合并进行综合性生物信息学分析，总结分析了牛乳中573种蛋白质的编码基因及代谢途径，这些蛋白质涉及牛乳营养物质的运输、机体免疫防御及脂类代谢等功能，还有大量与细胞增殖过程和生理结构、血液系统相关的蛋白质。对牛乳中蛋白质种类的分析，增加了牛乳的利用广度。

2.1 酪蛋白蛋白质组学

酪蛋白蛋白质组学研究主要包括酪蛋白种类与异构体分析及磷酸化研究几个方面。2004年，Holland等[13]利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术发现了10种κ-酪蛋白的异构体。Ciavardelli等[14]利用电感耦合等离子体质谱法检测出牛乳中α-酪蛋白和β-酪蛋白磷酸化位点，使酪蛋白的磷酸化逐渐成为研究酪蛋白蛋白质组学的研究重点[15]。

2.2 乳清蛋白质组学

乳清蛋白占牛乳蛋白质总量的18%～20%，除α-乳白蛋白和β-乳球蛋白外，还含有较大量的免疫球蛋白。近年来，通过蛋白质组学分析发现，乳清蛋白中含量最大的蛋白质种类为机体防御蛋白质，包括含量较高的免疫球蛋白和含量较低的补体系统蛋白等[16]。目前，对于机体防御蛋白的关注较多，大量的研究希望通过乳清蛋白质组学找出预测牛乳房炎的生物标记物。乳房炎是奶牛饲养业中比较严重且常易出现的问题之一，它会直接影响奶牛的牛乳产量和奶牛的繁殖性能。对于临床型乳房炎的检测比较容易，因为临床型乳房炎有非常清楚的发病迹象。但是对于隐型乳房炎的检测，目前还没有特别快捷准确的方法。因此，随着蛋白质组学技术的发展，人们希望通过对比临床型乳房炎、隐型乳房炎及健康乳房分泌的乳清蛋白，发现蛋白质种类及组成的差异，找出可以预测隐型乳房炎的生物标记物。 Boehmer等[17]利用蛋白质组学技术对比了受大肠杆菌侵染的乳房在侵染不同时间后分泌的乳清蛋白组成和含量差异，发现抗菌肽-1蛋白和肽聚糖识别蛋白受体蛋白的含量随着侵染时间及体细胞数的增加而增加。Alonso-Fauste等[18]对比了健康及乳房炎乳清，发现乳房炎乳中含有大量细胞源蛋白质，而健康乳清中没有此类蛋白或者含量很低，免疫相关蛋白质的含量在健康乳和乳房炎乳中都不同。另外，前列腺素D合成酶也是一种预测乳房炎的生物标记物[19]。

2.3 乳脂肪球膜蛋白质组学

近年来，备受关注的另外一个乳蛋白组分是乳脂肪球膜蛋白。 乳脂肪球在内质网双层膜中形成并分泌到细胞质中，在分泌的过程中，内质网外膜会覆盖在乳脂肪球上。乳脂肪球在细胞质中互相融合并移动到顶端质膜，通过特殊的类似于发芽的过程，乳脂肪球分泌到牛乳中，在这个分泌过程中，细胞膜的双层膜结构会覆盖在乳脂肪球上。另外，部分细胞质中的物质也会被包裹在乳脂肪球内膜(内质网外层膜)和外膜(细胞膜)之间。因此，乳脂肪球膜蛋白质包含来自于内质网、细胞膜及细胞质中的蛋白质，可以部分代表泌乳细胞中的蛋白质[20,21]。由此，近些年来部分研究通过对乳脂肪球膜蛋白质组成及种类的分析揭示泌乳机理。 尽管乳脂肪球膜蛋白只占总乳蛋白质的1%～2%，但是它却是乳蛋白不同组分中最具有多样性的蛋白质。Lu 等[22]利用过滤器辅助样品前处理方法结合质谱分析技术，在乳脂肪球膜中检测出169种蛋白质，并根据蛋白质的功能性质进行了分类，发现乳脂肪球膜蛋白包括免疫相关蛋白质、信号传导蛋白质、蛋白质运输、脂类代谢和细胞周期附着等生理功能相关蛋白质。在动物生理学对泌乳机理的研究中，常用的研究对象为牛乳房组织，但是提取牛乳房组织是一个复杂的过程，会影响奶牛的后续泌乳，因此乳脂肪球膜蛋白质成为一个简单易得的替代物。Lu等[23]研究了负能量平衡和正能量平衡奶牛分泌的乳脂肪球膜蛋白的差别，发现处于负能量平衡的奶牛会分泌急性期蛋白，而正能量平衡的奶牛会分泌较多胆固醇合成蛋白和Stomatin蛋白质，初步揭示了能量平衡对泌乳生理过程的影响。Reinhardt等[24]对比了泌乳第7 d和初乳的乳脂肪球膜蛋白质，发现与泌乳相关的黄嘌呤氧化酶、嗜乳脂蛋白、脂肪分化相关蛋白随着泌乳时间的延长而增加，另外第7 d牛乳中含有较高含量的脂类代谢相关蛋白质，而载脂蛋白A、 CIII、E和A IV的含量在第7 d较低。研究初步揭示了随着泌乳期增加泌乳细胞中代谢途径的变化。

3 展望

蛋白质组学在蛋白质组成、含量及结构研究中起到了重要的作用。牛乳蛋白质组学可以帮助理解牛乳的合成与分泌过程，为生产符合需要的乳制品提供理论基础。同时，还可应用于研究生产加工过程对牛乳蛋白质的影响，帮助优化牛乳加工技术。通过对牛乳蛋白质组成的深入了解，对充分利用牛乳为人类营养健康做贡献提供了基础知识。

参 考 文 献

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