血清miR-221表达与肝动脉化疗栓塞治疗肝癌患者预后的关系

张显伟 曹 宏 田晓丰

1.吉林省辽源市中医院外二科，吉林辽源 136200；2.吉林大学中日联谊医院外科，长春 130033

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系统最常见的恶性肿瘤。目前我国每年因HCC死亡的患者超过10万人，约占世界HCC病死率的45%[1]。由于HCC起病隐匿，早期患者无明显症状，多数患者发现时已多为中晚期并伴有严重的肝硬化，丧失了手术切除治疗的机会。因此，对于中晚期HCC患者，肝动脉化疗栓塞术（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）是目前首选的非手术治疗方法[2]。虽然TACE能有效提高HCC患者的生存时间。然而，TACE术后HCC的复发/转移是影响其远期疗效的最重要因素，且目前尚无有效预测TACE疗效和预后的生物指标[3]。miRNA是近年来发现的一类在真核生物中广泛存在长度为20～25 nt的非编码调控单链小分子RNA[4]。大量研究显示，miRNA在恶性肿瘤的发生和发展过程中起着非常重要的作用，且血液循环中肿瘤相关miRNAs还能作为诊断癌症的生物学标志[5-6]。最近的研究表明，miR-221在HCC患者癌组织和血清中的表达与HCC的发生和预后密切相关[7]。本研究通过检测TACE治疗前后HCC患者血清中miR-221表达水平的变化情况，探讨血清miR-221能否成为判定HCC患者TACE治疗的预后指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年3月～2012年6月在本院行TACE治疗的58例HCC患者，另取32例健康体检者血清样本作为对照组。所有患者均经组织病理学检测证实为HCC，诊断均符合2001年HCC临床诊断标准和临床分期。入组标准：①病灶数≤3个，肿瘤最大直径≤10 cm；②无肝内、外转移及无门静脉癌栓形成；③肝功能分级为Child-Pugh A级或B级；④此前未接受过任何治疗；⑤患者及其家属被明确告知且签署知情同意书，并经医院伦理委员会审核通过。

1.2 主要试剂及仪器

Trizol试剂、RNAisoTMPlus和实时荧光定量PCR试剂盒均购于日本Takara公司；Taq Man MicroRNA Assay和miRVanaTMmiRNA Isolation Kit购于美国Ambion公司。miR-221及U6引物序列购于上海吉凯基因化学技术有限公司；电泳仪、DU-730紫外分光光度计和ABIPRISM 7900实时荧光定量PCR仪购于美国ABI公司。

1.3 肝动脉化疗栓塞治疗

患者常规术前准备，经皮股动脉穿刺成功，置入导管至腹腔动脉或肝动脉并行选择性造影，明确肿瘤大小、位置和血管分布情况。微导管超选择肿瘤供血动脉，将化疗药物阿霉素60 mg+奥沙利铂50 mg+超液化碘化油混成乳剂缓慢灌注，最后用明胶海绵栓塞供瘤动脉血管。1.4实时荧光定量PCR检测血清miR-221的表达

①血清的分离收集：所有患者均在TACE前1～5 d及术后1个月空腹采集静脉血5 ml，将其置于室温下1 h。然后4℃，3000 r/min条件下离心15 min，收集上清（血清）置于-80℃冰箱待测。②血清RNA的提取：采用Trizol一步法提取血清中的总RNA，通过异丙醇法沉淀浓缩RNA，75%乙醇洗涤RNA沉淀。DU-730紫外分光光度计进行RNA定量，1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。将提取出的RNA样品保存于-80℃冰箱。③逆转录：按照TaqMan MicroRNAAssay的说明进行操作。准备25μl逆转录反应混合物：总 RNA 5 μl/Conc，100 mmol/LdNTPs（with dTTP）0.25 μl，Multiscribe 逆转录酶（50 U/μl）1.67 μl，10×逆转录缓冲液 2.5 μl，RNA 水解酶抑制剂 （20 U/μl）0.32 μl，无RNA酶水 2.46μl，逆转录引物12.8μl。 在 Gene Amp PCR System 9700进行 RT 反应。 反应条件：16℃，30 min；37℃，60 min；90℃，5 min。④实时荧光定量反应：以U6为内参基因，建立32μl反应体系：TaqMan Universal PCR Master Mix 16 μl，20×TaqMan MicroRNA Assay mix 12.8 μl， 逆转录产物2.5μl，无RNA酶水 0.7μl。 在ABI PRISM 7900实时荧光定量PCR仪进行反应。反应条件如下：95°C，15 min；40个 PCR 循环（95℃，30 s；60℃，20 s；75℃， 20 s）。 数据采用2-ΔΔCT法对 miR-221 表达进行分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组数据组间差异的分析采用配对t检验，Kaplan-Meier法计算平均疾病进展时间（TTP）和中位生存期（MST），以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TACE术前血清miR-221表达与HCC临床资料的比较

58例HCC患者血清miR-221的表达水平与临床资料的关系见表1。HCC患者血清miR-221的表达水平在AFP、肿瘤大小、肿瘤分化程度及TNM分级方面差异有统计学意义（P<0.05）。与性别、年龄、肝硬化、Child-Pugh分级、肿瘤直径和癌栓无明显关系（P>0.05）。

表1 术前HCC患者血清miR-221表达水平与HCC临床资料的比较（±s）

表1 术前HCC患者血清miR-221表达水平与HCC临床资料的比较（±s）

临床病理参数 例数 miR-221 t值 P值性别0.126>0.05男女41 17 9.70±2.67 9.84±3.05年龄（岁）<60≥60肿瘤直径（cm）≤5>5肿瘤分化高中分化低分化肝硬化0.364>0.05 39 19 9.82±2.71 9.66±2.87 0.457>0.05 36 22 9.43±3.08 10.26±3.27 3.677<0.05 38 20 7.84±2.79 13.20±5.77 0.483>0.05有无37 21 10.08±2.91 9.04±2.84 Child-Pugh A级B级术前AFP水平（μg/L）AFP<20 AFP≥20 TNM分期0.325>0.05 34 24 9.45±2.78 10.12±2.96 4.459<0.05 12 46 5.87±3.76 10.72±2.95 2.787<0.05ⅠⅡⅢ癌18 29 11 6.34±3.84 9.89±3.12 12.08±4.22栓有无0.307>0.05 16 42 10.69±3.66 9.34±2.72

2.2 TACE治疗前后HCC患者血清miR-221表达的变化情况

HCC患者TACE术前血清miR-221的相对表达水平为 9.73±2.64，明显高于健康对照组（1.69±0.53），TACE 术后1个月HCC患者血清miR-221的相对表达水平为3.85±1.17，较术前明显降低（P<0.05）。

2.3 TACE术前血清miR-221的表达水平与患者TTP和MST的关系

按TACE术前HCC患者血清miR-221的平均相对表达水平9.73分组，将58例HCC患者分为miR-221高表达组（38例）和低表达组（20例）。高表达组TTP和MST分别为9.8个月和14.3个月，而低表达组TTP和MST分别为13.7个月和17.2个月，差异有统计学意义（P<0.05）（图1，图2）。

3 讨论

目前非编码的miRNA分子研究已经成为生命科学研究的热门领域。随着近年来对miRNA与肿瘤发生、发展之间关系研究的逐步深入，发现miRNA与肿瘤的发生、发展、复发、转移以及预后密切相关[8]，即miRNA在肿瘤的早期诊断和治疗等方面表现出良好的潜能。因此，科学家们推测miRNA可能是一种理想的肿瘤检测分子标志及治疗靶点[6，9]。

miR-221基因定位于X染色体p11.3区约1 kb的区域内。近来研究表明，miR-221参与调控一系列生物进程，如造血、血管生成、细胞增殖和凋亡等。此外，miR-221参与多种恶性肿瘤（如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、黑色素瘤等）的发生，并在恶性肿瘤细胞中的表达明显上调，表现为一种“通用”的促癌基因[10-11]。其致癌机制可能 通 过 对 p27、GHR、HIF-1β、CDKN1C/p57、PUMA、Bmf、c-kit、DDIT4等癌基因的调控来调节细胞周期和增殖能力，抑制细胞分化和凋亡，从而参与肿瘤的发生和发展[12-13]。本研究采用RT-PCR检测HCC患者血清miR-221表达情况以及TACE预后的关系。结果显示，TACE术前患者血清miR-221表达水平较健康对照组明显升高。通过与HCC临床病理因素分析显示患者血清miR-221的表达水平在AFP、肿瘤大小、肿瘤分化程度及TNM分级方面差异有统计学意义（P<0.05），与性别、年龄、肝硬化、Child-Pugh分级、肿瘤直径和癌栓无明显关系（P>0.05），提示血清miR-221与HCC的发生和疾病进程存在一定的关联，这与相关文献的报道是一致的[7]。TACE术后患者血清miR-221表达水平出现大幅降低，提示miR-221参与了HCC发生、发展的调控过程，也提示其可作为一个新的HCC诊断标志物。根据血清miR-221表达平均水平对HCC患者进行分组，结果显示，低值组TTP和MST显著高于高值组，说明血清miR-221在判断HCC预后上也存在一定意义。然而，miR-221调控HCC进程的具体机制尚需进一步研究。

总之，血清miR-221的检测不仅可以作为HCC的早期诊断标志物，也有利于对临床上HCC患者判断病情、及时治疗及改善预后。

[1]El-Serag HB，Rudolph KL.Hepatocellular carcinoma：epidemiology and molecular carcinogenesis[J].Gastroenterology，2007，132（7）：2557-2576.

[2]Biolato M，Marrone G，Racco S，et al.Transarterial chemoembolization（TACE） for unresectable HCC：a new life begins?[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2010，14（4）：356-362.

[3]李家开，于淼.肝细胞肝癌的微创介入治疗进展及合理应用[J].中华临床医师杂志（电子版），2012，6（10）：2559-2562.

[4]Schanen BC，Li X.Transcriptional regulation of mammalian miRNA genes[J].Genomics，2011，97（1）：1-6.

[5]Xie L，Qian XP，Liu BR.Novel tumor markers-circulating miRNA[J].Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2011，33（9）：641-642.

[6]Shah AA，Leidinger P，Blin N，et al.miRNA： small molecules as potential novel biomarkers in cancer[J].Curr Med Chem，2010，17（36）：4427-4432.

[7]Li J，Wang Y，Yu W，et al.Expression of serum miR-221 in human hepatocellular carcinoma and its prognostic significance[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，406（1）：70-73.

[8]Di Leva G，Croce CM.miRNA profiling of cancer[J].Curr Opin Genet Dev，2013，23（1）：3-11.

[9]Sethi S，Li Y，Sarkar FH.Regulating miRNA by natural agents as a new strategy for cancer treatment[J].Curr Drug Targets，2013，14（10）：1167-1174.

[10]Pineau P，Volinia S，Mcjunkin K，et al.miR-221 overexpression contributes to liver tumorigenesis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（1）：264-269.

[11]Di Leva G，Gasparini P，Piovan C，et al.MicroRNA cluster 221-222 and estrogen receptor alpha interactions in breast cancer[J].J Natl Cancer Inst，2010，102（10）：706-721.

[12]le Sage C，Nagel R，Egan DA，et al.Regulation of the p27（Kip1） tumor suppressor by miR-221 and miR-222 promotes cancer cell proliferation[J].EMBO J，2007，26（15）：3699-3708.

[13]Hwang MS，Yu N，Stinson SY，et al.miR-221/222 targets adiponectin receptor 1 to promote the epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer[J].PLoSOne，2013，8（6）：e66502.