可溶性HLA-G二聚体在体外可抑制树突状细胞的成熟①

张 娣 单士刚 陈 俊 刘川桥 梁智辉 翁秀芳 吴雄文

(华中科技大学同济医学院免疫学系，武汉430030)

HLA-G是一种非经典的HLAⅠ类分子，主要表达在接触母体组织的胎儿滋养层细胞上，被认为在维持母胎耐受中起重要作用。Abderrahim Naji等报道接受移植的病人排斥反应程度与HLA-G在血清中的含量成反比［1］。DC在固有免疫与适应性免疫中发挥重要作用［2］，未成熟DC有很强的摄取、加工和处理抗原的能力，而成熟DC则发挥很强的抗原提呈功能。HLA-G可以通过与抑制性受体结合诱导免疫耐受，这些抑制性受体主要包括 ILT2与ILT4，主要表达在 T、B、NK、DC和巨噬细胞等表面［3］。相对于可溶性HLA-G单体而言，HLA-G二聚体与这些抑制性受体的亲和力更强，诱导免疫耐受的效应则更强［4］。近年来有文献报道可溶性HLA-G四聚体在体内能够抑制DC的成熟［5］，也有人报道可溶性HLA-G单体可通过DC抑制同种T细胞增殖，但对DC的成熟却没有影响［3］。本研究拟采用文献中报道诱导DC成熟的几种方法，在同一实验条件下探讨可溶性HLA-G二聚体对DC成熟的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源 武汉血液中心。

1.2 主要试剂 人外周血淋巴细胞分离液，天津市灏阳生物制品生产。rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α、IFN-γ均购自PeproTech公司。CD1a(HI149)、CD83(HB15e)单抗购自eBioscience公司。CD40(5C3)购自BioLegend公司。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，按照说明书配制。杭州四季青胎牛血清，56℃、30分钟灭活后使用。可溶性HLA-G二聚体由本实验室构建与表达［6］。

1.3 DC的培养 取健康献血者的外周血，用PBS对倍稀释，外周血淋巴细胞分离液密度梯度离心(2 000 r/min，30分钟)后，获得外周血单个核细胞(PBMC)，PBS洗涤2～3次，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×108ml-1，接种到6孔板中，每孔2×107个细胞，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养2小时，去掉悬浮细胞，每孔加3 ml培养基，并加入rhM-CSF与rhIL-4，终浓度分别为15 ng/ml和 10 ng/ml。5天后加入 TNF-α 或IFN-γ，终浓度为10 ng/ml。同时加入可溶性HLA-G二聚体上清，终浓度为0.8 μg/ml，并设置721.221上清组作为对照，于第7天收获细胞。

1.4 形态学观察 在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，单核细胞在加入细胞因子后形态发生了明显改变。

1.5 免疫表型检测 流式细胞仪检测DC的表面标志，收获培养7天后的细胞，离心，每管加100 μl PBS和 CD1a、CD83、CD40单抗，混匀后4℃避光孵育30分钟，每隔10分钟振摇一次，再用PBS离心洗涤一次，最后每管细胞用200～300 μl PBS悬起，流式细胞仪检测。

图1 单核细胞经GM-CSF、IL-4及TNF-α或 IFN-γ诱导7天后的DC形态(倒置相差显微镜，×400)Fig.1 The morphology of DC from monocyte induced by GM-CSF，IL-4 and TNF-α or IFN-γ (inverted phase contrast microscope，10×40 times)

2 结果

2.1 DC的形态观察 新分离的外周血单个核细胞呈圆形，分散分布，大小均等，去掉悬浮细胞后的贴壁细胞在加入GM-CSF和IL-4后的第3～4天部分细胞开始呈半悬浮状态，聚集成团，6到7天后半悬浮细胞增多，细胞团也明显增多，细胞周围出现大量树枝状棘突，呈现典型的DC形态，如图1所示，与文献报道一致［7］。

2.2 细胞免疫表型结果 CD1a表达在所有DC表面，CD83只表达在成熟DC表面，CD40随着DC的成熟表达增加。流式仪检测结果:单核细胞体外经GM-CSF、IL-4及TNF-α或IFN-γ诱导为DC的典型散点图，如图2，TNF-α或IFN-γ诱导的成熟DC组、721.221上清组、可溶性HLA-G二聚体组CD1a+CD83+、CD1a+CD40+阳性率统计学分析结果显示:无论刺激DC成熟的是TNF-α还是IFN-γ，可溶性HLA-G二聚体组CD1a+CD83+、CD1a+CD40+阳性率明显低于721.221上清组，差异有统计学意义(P＜0.05)。另外，由图3还可以得出:IFN-γ刺激组成熟DC百分率与TNF-α刺激组相比无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。

图2 单核细胞体外经GM-CSF、IL-4及TNF-α或IFN-γ诱导成DC的典型散点图Fig.2 The typical scatter diagram of DC from monocyte induced by GM-CSF，IL-4 and TNF-α or IFN-γ in ritro

表1 可溶性HLA-G二聚体体外可抑制树突状细胞的成熟(±s，%)Tab.1 The soluble of HLA-G dimer can inhibit the mature of DC in vitro(±s，%)

表1 可溶性HLA-G二聚体体外可抑制树突状细胞的成熟(±s，%)Tab.1 The soluble of HLA-G dimer can inhibit the mature of DC in vitro(±s，%)

Note:There is significant difference between these two groups，1)P ＜0.05.Mature DC 1，Supernatant of 721.221 1 and Soluble HLAG dimer 1 are induced by TNF-α.Mature DC 2，Supernatant of 721.221 2 and Soluble HLA-G dimer 2 are induced by IFN-γ.

Groups CD1a+CD83+ CD1a+CD40+Mature DC 1 40.58±18.23 76.63±12.10 Supernatant of 721.221 11) 40.14±12.23 75.02±15.35 Soluble HLA-G dimer 11) 29.95±17.87 41.69±20.71 Mature DC 2 36.50±18.84 60.49±18.75 Supernatant of 721.221 21) 35.86±13.51 58.29±14.17 Soluble HLA-G dimer 21)23.73±15.81 40.43±23.79

图3 可溶性HLA-G二聚体在体外可抑制树突状细胞的成熟Fig.3 The soluble of HLA-G dimer can inhibit the mature of DC in vitro

3 讨论

HLA-G是一种非经典的 HLA-Ib类分子，与HLA-Ia抗原相比，HLA-G具有低度多态性和分布局限性的特点，主要在绒毛外细胞滋养细胞有高水平表达，这与HLA-G诱导母胎耐受的作用有关。其通过与免疫细胞表面抑制性受体结合来抑制广泛的免疫反应，如ILT2及ILT4［7］，这些抑制性受体主要表达在T、B、NK、DC和巨噬细胞等表面。文献报道可溶性HLA-G二聚体与这些抑制性受体的亲和力更强，诱导免疫耐受的作用更大。

DC在调节适应性免疫反应中起重要作用。另外，还参与免疫耐受的建立。免疫耐受作用是通过特异性的DC亚群调节的，称为耐受性DC，这群DC的免疫抑制作用是通过诱导调节性T细胞产生的［8］。关于诱导DC的方法，曾有文献报道用GMCSF、IL-4便可得到未成熟 DC［3］，在培养第 5 天加入TNF-α/IFN-γ/LPS可得到成熟DC。各种细胞因子的作用如下:GM-CSF能使单核细胞向DC及巨噬细胞分化。IL-4则能抑制巨噬细胞形成，促使DC定向诱导分化，并能维持DC于未成熟状态。TNF-α可抑制粒细胞产生，同时可促进DC成熟。IFN-γ可激活单核细胞，促进DC表达MHCⅡ类分子，即可促进DC成熟。本实验诱导DC方法与文献报道一致。经诱导后的DC在显微镜下可观察到其典型形态:半悬浮，成团，树突状。

根据文献报道，可溶性HLA-G二聚体可通过与DC表面的抑制性受体结合而抑制DC的成熟，表现为共刺激分子如 CD80、CD86表达水平下降［9］，从而进一步诱导T、B细胞的免疫耐受。但也有文献报道可溶性HLA-G二聚体可以抑制DC诱导的同种T细胞增殖，但并不影响 DC的分化与成熟［3］。本实验首先分离人外周血中的PBMC，然后利用细胞因子 GM-CSF、IL-4及 TNF-α/IFN-γ刺激单核细胞得到DC，并探讨可溶性HLA-G二聚体在DC成熟过程中的作用。流式细胞仪检测结果显示，刺激成熟的因子为TNF-α或IFN-γ时，可溶性HLA-G二聚体都可以抑制DC的成熟。结果还显示:用TNF-α或IFN-γ作为刺激成熟的因子均可诱导DC成熟，但TNF-α刺激成熟的作用较 IFN-γ更强。关于HLA-G抑制DC成熟的机制，有文献报道与IL-6-STAT3 信号通路有关［10］。

有文献报道，CD40-CD40L(CD154)参与诱导耐受性DC，在自身免疫病、移植排斥反应和诱导免疫耐受中发挥重要作用［11］。另有文献报道，HLA-G与ILT4受体结合发挥的强大效应或许在耐受性疫苗治疗自身免疫性疾病的发展或维持移植免疫耐受等某些临床应用中有重要作用［11］。本实验证实了可溶性HLA-G二聚体在体外可抑制DC的成熟，这或许对可溶性HLA-G二聚体在某些临床疾病中的应用提供线索。

1 Abderrahim Naji，Antoine Durrbach，Edgardo D et al.Soluble HLAG and HLA-G1 expressing antigen-presenting cells inhibit T-cell alloproliferation through ILT-2/ILT-4/FasL-mediated pathways［J］.Human Immunol，2007;68(4):233-239.

2 Vladimir Ristich，Siyuan Liang，Wei Zhang et al.Tolerization of dendritic cells by HLA-G［J］.Eur J Immunol，2005;35(4):1133-1142.

3 Gaëlle Le Friec，Béatrice Laupèze，Olivier Fardel et al.Soluble HLA-G inhibits human dendritic cell-triggered allogeneic T-cell proliferation without altering dendritic differentiation and maturation processes［J］.Human Immunol，2003;64(8):752-761.

4 Mitsunori Shiroishi，Kimiko Kuroki，Toyoyuki Ose et al.Efficient leukocyte Ig-like receptor signaling and crystal structure of disulfide-linked HLA-G dimer［J］.J Bio Chem，2006;281(15):10439-10447.

5 Siyuan Liang，Anatolij Horuzsko.Mobilizing dendritic cells for tolerance by engagement of immune inhibitory receptors for HLA-G ［J］.Human Immunol，2003;64(11):1025-1032.

6 Zhong M，Weng X，Liang Z et al.Dimerization of soluble HLA-G by IgG-Fc fragment augments ILT2-mediated inhibition of T-cell alloresponse［J］.Transplantation，2009;87(1):8-15.

7 Franqoise Chapuis，Michelle Rosenzwajg，Micael Yagello et al.Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro［J］.Eur J Immunol，1997;27(2):431-441.

8 Kimiko Kuroki，Katsumi Maenaka.Immune modulation of HLA-G dimer in maternal-fetal interface ［J］.Eur J Immunol，2007;37(7):1727-1729.

9 Gregori S.Dendritic cells in networks of immunological tolerance［J］.Tissue Antigens，2011;77:(2):89-99.

10 Siyuan Liang，Vladimir Ristich，Hisashi Arase et al.Modulation of dendritic cell differentiation by HLA-G and ILT4 requires the IL-6—STAT3 signaling pathway［J］.PNAS，2008;105(24):8357-8362.

11 Karimi M H，Pourfathollah A A.CD40 and tolerance induction［J］.Iran J Allergy Asthma Immunol，2012;11(1):1-13.