CD123+CD11c－pDC在初发类风湿关节炎患者外周血及关节液中的表达①

罗 莉 胡永玮 刘盼盼 吉 鹏 杜文静

(新疆医科大学第一附属医院风湿科，乌鲁木齐830054)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性对称性炎症性多关节炎为主要表现的自身免疫性疾病，其发生、发展与多种诱发因素及机体免疫紊乱相关，其中抗原提呈功能异常是重要的一部分。树突状细胞(Dendritic cell，DC)是目前所知功能最强大的抗原提呈细胞，通过起始机体免疫应答，诱发免疫耐受等参与免疫反应。CD123+CD11c－是淋巴系来源的树突状细胞的标记分子［1］，CD123+CD11c－树突状细胞在RA中的免疫作用已受到关注，但目前研究较少。我们拟通过测定RA患者外周血及关节液中pDC的表达水平，探讨其在RA发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象及主要试剂

1.1.1 研究对象 RA组:30例类风湿关节炎患者，均来自新疆医科大学第一附属医院风湿科住院患者，符合1987年美国风湿病学会(ACR)修订的RA诊断标准。所有患者均符合RA活动指标:晨僵时间＞1小时，肿胀关节数＞4个，压痛关节数＞5个，红细胞沉降率(ESR)＞28 mm/h，C反应蛋白(CRP)＞8 mg/L。研究纳入患者均为初次发病，就诊前未用过缓解病情抗风湿药或激素类药物。其中男性4例，女性26例，年龄25～63岁，平均(47±4.9)岁，OA组:选取新疆医科大学第一附属医院风湿科住院患者，符合美国风湿病协会制定的骨关节炎诊断标准，其中男性5人，女性20人。排除其他风湿性疾病。健康对照组:本院职工健康志愿者25人，男性5人，女性20人，体检各项指标均在正常范围内，与RA组在年龄和性别上均匹配。

1.1.2 主要试剂 2011年试验所用试剂:FITC标记的抗人MHCⅡ;PE标记的抗人CD123;PE-cy7标记的抗人CD11c以及同型对照抗体均购自BD/Pharmingen公司(Becton Dickinson/PharMingen USA)。红细胞裂解液购自Beckman Coulter公司。2012年试验所用试剂:FITC标记的抗人Lineage 2;PE标记的抗人CD123;PerCP-Cy5.5标记的MHCⅡ;PE-cy7标记的抗人CD11c以及同型对照抗体均购自BD/Pharmingen公司(Becton Dickinson/PharMingen USA)。红细胞裂解液购自Beckman Coulter公司。

1.1.3 主要仪器 流式细胞仪(BD LSRⅡ，USA);离心机 Centrifuge 5810R(Effendorf，Germany)。

1.2 免疫荧光标记和流式细胞术检测 收集患者及对照组外周抗凝血及关节积液100 μl，分别加入FITC标记的抗人 MHCⅡ抗体，PE标记的抗人CD123抗体，PE-cy7标记的抗人CD11c抗体各20 μl;或 FITC标记的抗人 Lineage 2抗体;PE标记的抗人CD123抗体;PerCP-Cy5.5标记的MHCⅡ抗体;PE-cy7标记的抗人CD11c抗体各20 μl;同型对照管100 μl抗凝血中分别加入同型对照20 μl。室温避光孵育30分钟，加入红细胞裂解液500 μl，PBS洗涤2次，离心后弃上清，然后再加入100 μl FACS缓冲液重悬细胞置于流式细胞仪上检测。使用美国BD公司的LSRⅡ流式细胞仪，按规程操作。

1.3 统计学分析 数据采用SPSS17.0统计软件处理。数据以±s表示，根据方差齐性检验结果，两组间比较采用独立样本t检验，不同指标之间进行Spearman相关分析。

2 结果

2.1 RA组与OA组及健康对照组外周血CD123+CD11c－pDC细胞百分率比较 RA组外周血CD123+CD11c－pDC 细胞百分率(1.69% ±0.97%)低于 OA组(5.38% ±2.31%)及健康对照组(5.63% ±2.33%)，差异分别有统计学意义(P＜0.05)，见表1，图1。

表1 RA组与OA组及健康对照组外周血中pDC百分率比较(±s，%)Tab.1 pDC percentage in peripheral blood of RA group，OA group and control group(±s，%)

表1 RA组与OA组及健康对照组外周血中pDC百分率比较(±s，%)Tab.1 pDC percentage in peripheral blood of RA group，OA group and control group(±s，%)

Note:Compared to OA group，1)P ＜0.05;compared to control group，2)P ＞0.05;compared to RA group，3)P ＜0.05.

Groups n Perpheral blood RA 30 1.69% ±0.97%1)OA 25 5.38% ±2.31%2)Control 25 5.63% ±2.33%3)

图1 流式细胞术检测RA组与对照组外周血中pDC细胞百分率的表达Fig.1 Expressing of individual pDC percentage in the peripheral blood control and RA patients

表2 RA组与OA组关节液中pDC百分率比较(±s，%)Tab.2 pDC percentage in synovial fluid of RA group and OA group(±s，%)

表2 RA组与OA组关节液中pDC百分率比较(±s，%)Tab.2 pDC percentage in synovial fluid of RA group and OA group(±s，%)

Note:Compared to OA group，1)P ＞0.05.

Groups n Synovial fluid RA 30 3.63% ±2.7%1)OA 25 1.84% ±1.67%

2.2 OA组和健康对照组外周血CD123+CD11cpDC细胞百分率比较 OA组外周血CD123+CD11c－pDC 细胞百分率(5.38% ±2.31%)低于健康对照组(5.63% ±2.33%)，差异无统计学意义(P ＞0.05)，见表1。

2.3 RA组与OA组关节液CD123+CD11c－pDC细胞百分率比较 RA组关节液CD123+CD11c－pDC细胞百分率(3.63% ±2.7%)高于对照组(1.84% ±1.67%)，差异无统计学意义(P ＞0.05)，见表2。

2.3 RA患者外周血pDC百分率与临床指标的相关性分析 利用统计软件对RA患者外周血及关节液pDC细胞百分率与临床指标进行相关性分析，两者与疾病DAS28评分无相关性，与疾病活动度指标ESR、CRP和RF亦无相关性。

3 讨论

类风湿性关节炎(RA)是一种常见的自身免疫性疾病，在全世界约有1%的人患有此病。其特点是以关节滑膜炎为特征的慢性全身性炎性反应，滑膜炎持久反复发作，导致关节内软骨和骨质破坏，关节功能障碍，终致残废。其发病机制尚不十分明确，发病机理复杂，目前认为主要以细胞免疫为主，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、活化T细胞通过多种途径影响滑膜细胞和淋巴细胞的增殖和分化，促进滑膜细胞和软骨细胞合成并释放炎症介质，引发滑膜的炎性反应、软骨基质的崩解，造成关节损伤［2］。树突状细胞是其中功能强大的抗原提呈细胞，近年研究发现DC在RA中诱导初始T细胞分化为Th1细胞或Th2细胞，调节Th1/Th2的平衡、在不同成熟状态诱导T细胞产生促炎或抑炎因子参与细胞免疫。还可诱导T细胞依赖或非依赖性B细胞向浆细胞分化，调节自身抗体生成，参与部分体液免疫［3］。

人DC的来源可分为两个亚群:骨髓系来源的树突状细胞(Myeloid dendritic cell，mDc)，高表达CD11c，低表达CD123;淋巴系来源的浆细胞样树突状细胞(pDC)，高表达 CD123，不表达CD11c等髓系标记［1］。国外研究者在人类扁桃体中发现表达CD4+CD3－CD11c－的细胞出现在 T细胞聚集区［4，5］，但不表达 T细胞受体。进一步发现细胞形态似淋巴样，类浆细胞样，在 IL-3或 IL-3联合CD40L刺激下可分化为成熟的树突状细胞。而CD123为DC细胞表面IL-3受体α链，在人pDC高表达。因此推测表达CD123但不表达CD11c的DC为不成熟pDC。故本实验中CD123+CD11c-标记的DC为不成熟状态的pDC。

Sarah L Jongbloed等［6］报道称RA患者外周血及关节液中pDC均处在不成熟状态，关节液较外周血细胞更为幼稚。未成熟pDC可诱导T细胞失能，有研究发现自身免疫性硬化病中存在对拓扑异构酶I特异性反应的CD4+T细胞，当这些CD4+细胞与用该酶冲击过的人外周血未成熟pDC培养，发现CD4+T细胞失能，不能对特异抗原刺激表现出增殖反应，对B细胞自身抗体协同刺激作用消失。结果提示外周不成熟pDC可诱导自身CD4+T细胞介导免疫反应无应答［7］。经IL-3及CD40L刺激后，pDC可诱导幼稚型T细胞分化为CD8+调节性T细胞，促进Th2生成并分泌IL-4、IL-5、IL-10，抑制炎症反应［8］。本实验中RA组外周血pDC较对照组有显著下降，这与Christophe Richez等人［3］的研究结果一致。推测在外周血中CD123+CD11c－pDC数量减少，其诱导失能及抑制性免疫作用减弱，相对促进全身免疫反应。故实验结果提示RA患者体内存在细胞免疫功能的紊乱。

Roberto Lande等［9］发现RA患者关节液存在抑制pDC成熟的细胞因子，且在Lin-CD123++pDC表面发现表达下调细胞成熟的BDCA2，提示关节液中pDC也处于不成熟状态。唐蓓［10］发现在DC成熟过程中，MHCⅡ表达增高，并表达协同刺激分子CD80、CD86、CD40。Jongbloed 等［6］分离 RA 患者关节液中pDC，并经CpG ODN2216刺激后发现其高表达CD80、CD83及CCR7，刺激成熟后的pDC释放大量IFN-ɑ和TNF-ɑ，IL-10参与免疫反应。而仅IL-3刺激pDC不能表达成熟标记。本实验中测定关节液中CD123+CD11c－pDC含量较对照组比较差异无统计学意义。推测关节液中CD123+CD11c－pDC未经刺激成熟，其产生释放细胞因子能力弱，在关节炎症反应中不是主要调节细胞，在RA疾病进展中不是扮演主要角色。而本实验中还发现RA组外周血及关节液中pDC含量与DSA28评分，疾病活动指标均无相关性，进一步阐释CD123+CD11c－pDC与RA疾病发展缺乏相关性。

本研究中入组患者均为初发RA患者，未经药物治疗，体内免疫状态为初始状态，无药物干扰，故实验测定指标较为准确。研究结果提示CD123+CD11c－pDC在RA外周血中含量降低，免疫耐受能力减弱，相对促进全身炎症反应。为进一步明确pDC在类风湿关节炎患者靶器官的相关联系，我们计划测定不同成熟状态pDC及相关细胞因子、转录因子、信号传导途径等变化，深入分析pDC在类风湿关节炎中的作用机制。

1 Lebre M C，Tak P P.Dendritic cell subsets:Their roles in rheumatoid arthritis［J］.Acta Reumatol Port，2008;33:35-45.

2 Feldmann M，Bmnnan F M，Foxwen B M et al.The role of TNF-alpha and IL-1 in the rheumatoid arthritis［J］.Curt Dir Autoimmun，2001;3(2):188-199.

3 Christophe Richez，Schaeverbeke T，Dumoulin C et al.Myeloid dendritic cells correlate with clinical response whereas plasmacytoid dendritic cells impact autoantibody development in rheumatoid arthritis patients treated with infliximab［J］.Arthritis Research ＆ Therapy，2009;11:100-113.

4 Liu Y J.IPC:professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors ［J］.Annu Rev Immunol，2005;23:275-306.

5 Grouard G，Rissoan M C，Filgueira L et al.The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin(IL)-3 and CD40-ligand［J］.J Exp Med，1997;185:1101-1111.

6 Jongbloed S L，Lebre M C，Fraser A R et al.Enumeration and phenotypical analysis of distinct dendritic cell subsets in psoriatic arthritis and rheumatoid arthritis［J］Arthritis Research ＆ Therapy，2006;8:R15 doi:10.1186-1864.

7 Kuwana M，Kaburaki J，Wright T M et al.Induction of antigen specific human CD4+T cell anergy by peripheral blood DC2 precursors［J］.Eur J Immunol，2001;31(9):2547-2557.

8 Rissoan M C，Soumelis V，Kadowaki N et al.Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation.［J］Science，1999;283:1183-1186.

9 Roberto Lande，Elena Giacomini，Barbara Serafini et al.Characterization and recruitment of plasmacytoid dendritic cells in synovial fluid and tissue of patients with chronic inflammatory arthritis［J］Immunol，2004;173:2815-2824.

10 唐 蓓.LPS介导的树突状细胞成熟过程中的表型变化［J］.中国免疫学杂志，2012;28(2):114-121.