Lactobacillus casei胞外多糖对体外培养的巨噬细胞分泌TNF-α、NO及IL-10的影响①

徐智敏 唐彦君 刘 宁

(东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030)

巨噬细胞在免疫系统中占据着独一无二的位置，是机体发挥防御机制的基础［1］。当病原微生物入侵机体时，能够激活巨噬细胞分泌炎症介质来杀灭病原微生物，发挥其防御机制。但是如果巨噬细胞一直处于激活状态会释放过量的炎症因子，如NO、TNF-α等，从而造成瀑布式的炎症失控性反应，使组织损伤并成为炎症［2］。因此，寻找一种能够调节巨噬细胞活性，改善炎症反应的物质，将对维持免疫系统平衡具有重要的意义。Jie-Young Song等人研究发现人参能够促进巨噬细胞分泌促炎症因子IL-1β和IL-6，提高巨噬细胞的防御能力［3］。但从改善炎症反应方面，抑制这些促炎症因子的作用却未见报道。本研究通过采用双抗体夹心ELISA和Griess法，研究干酪乳杆菌EPS对体外培养的腹腔来源巨噬细胞分泌促炎症因子TNF-α和NO及抗炎症因子IL-10的影响。旨在探讨干酪乳杆菌胞外多糖对体外培养的巨噬细胞的双向调节机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 BALB/c雌性小鼠，体质量18～20 g，周龄6周，SPF级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(批号:2012-021316)，饲养于哈尔滨医科大学公共卫生学院动物实验中心无特定病原体动物室，环境温度24℃，湿度40% ～60%，光照12小时，实验前先将动物用标准饮食饲养7天以适应环境;J774A.1小鼠单核巨噬细胞(购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心);干酪乳杆菌(购自于美国ATCC，编号:ATCC393TM);干酪乳杆菌胞外多糖(由本实验室经干酪乳杆菌ATCC393TM发酵自制，纯度为97%);小鼠 TNF-α ELISA检测试剂盒(Sigma公司);小鼠IL-10 ELISA检测试剂盒(Sigma公司);LPS(Sigma公司);NO检测试剂盒(南京建成);DMEM高糖培养液(Hylcone公司)。

1.2 主要仪器 VD-1320型无菌操作台(北京东联哈尔仪器制造厂);HF90型CO2培养箱(HealFroce公司);AE-31型倒置显微镜(MOTIC公司);酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司);真空冷冻干燥机(上海医用仪器厂);GL-21M超速冷冻离心机;ZFQ85B旋转蒸发器(上海医械专机厂);DHP-9082电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 J774A.1 小鼠单核巨噬细胞的培养J774A.1细胞以1.0×105密度接种于50 ml塑料培养瓶中，用含10%胎牛血清与1%抗生素的DMED高糖培养液培养，置于37℃、5%CO2培养箱中，2～3天后待细胞汇合成单层细胞，用细胞刮将细胞轻刮下来，并转移至新的塑料培养瓶中进行次代培养。

1.3.2 小鼠腹腔巨噬细胞的制备与培养 实验前3天，向小鼠腹腔内注射2%淀粉肉汤2 ml，小鼠颈椎脱臼处死，置于75%酒精浸泡3分钟后取出，腹面朝上，用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤(小心勿将腹膜撕破)，完全暴露腹膜。用注射器向小鼠腹腔注射6 ml Hanks液，避开肠和脂肪，轻轻地回抽腹腔液，不同方向回抽冲洗数次(需要5分钟左右的时间)，吸出腹腔液于离心管中，以1 000 r/min离心5分钟，弃上清后，用DMEM高糖培养液重新悬浮细胞，置CO2培养箱，37℃培养2小时使巨噬细胞贴壁，然后用PBS洗去悬浮细胞。更换新鲜的DMEM高糖培养液，继续培养12小时后用于实验［4］。

1.3.3 设计及分组 在96孔板中每孔加入细胞悬液100 μl(1.0×105)，进行分组处理，分为空白对照组;胞外多糖处理组;脂多糖处理组;胞外多糖和脂多糖共处理组。

1.3.4 细胞因子的检测 收集细胞培养上清液，采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中 TNF-α、IL-10的浓度，实验按照ELISA试剂盒操作步骤来进行。采用Griess法测定细胞培养上清液中NO2－间接反映生成NO的量，按照NO检测试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 EPS对腹腔巨噬细胞形态学影响 如图1和2所示，在倒置显微镜下观察J774A.1巨噬细胞和原代腹腔巨噬细胞的细胞形态。空白对照组，没有外来物质刺激腹腔来源的巨噬细胞时，细胞的形态是圆形的;当用炎症刺激物LPS作用细胞后，腹腔来源的巨噬细胞形态发生较大的变化，由原来的圆形变成梭形，细胞边缘有树突状突起;用200 μg/ml的EPS处理细胞后，部分细胞形态由梭形、树突状恢复到椭圆形;当用400 μg/ml的EPS处理细胞后大部分细胞形态都由梭形、树突状恢复到原来的圆形。说明EPS能够恢复由脂多糖导致的巨噬细胞形态的变化。

2.2 EPS对腹腔来源巨噬细胞分泌促炎症因子TNF-α的影响 如图3所示，与空白对照组相比，不同浓度的EPS均能显著地促进腹腔巨噬细胞分泌TNF-α(P ＜0.01);EPS在350 ～ 450 μg/ml浓度范围内，腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的量是先增多后减少，EPS浓度为 400 μg/ml时，J774A.1 和原代腹腔巨噬细胞分泌 TNF-α的量分别达到最大值(458.18 ±8.679)pg/ml 和(387.28 ± 8.354)pg/ml。LPS能够促进腹腔巨噬细胞产生大量的TNF-α，与单独脂多糖组相比，不同浓度的EPS均能抑制由10 μg/ml LPS诱导的TNF-α的分泌;450 μg/ml浓度的EPS对J774A.1和原代腹腔巨噬细胞产生TNF-α的抑制率最大。

2.3 EPS对腹腔来源巨噬细胞分泌抗炎症因子IL-10的影响 如图4所示，与空白对照组相比，不同浓度的EPS均能显著地促进腹腔巨噬细胞分泌IL-10(P ＜0.01);EPS在 350～ 450 μg/ml浓度范围内，腹腔巨噬细胞分泌IL-10的量是先增多后减少，EPS浓度为400 μg/ml时J774A.1和原代腹腔巨噬细胞分泌IL-10的量分别达到最大值(74.18±3.924)pg/ml和(59.761 ±3.46)pg/ml。单独脂多糖处理组，抑制腹腔巨噬细胞分泌IL-10，不同浓度的EPS均能显著影响由10 μg/ml脂多糖导致的IL-10分泌的抑制(P ＜0.01)。

图1 倒置显微镜观察LPS和EPS对J774A.1细胞形态的影响(×400)Fig.1 Morphologic feature of J774A.1 cells treated with EPS and LPS was photographed using an inverted phase microscop(×400)

图2 倒置显微镜观察LPS和EPS对原代腹腔巨噬细胞形态的影响(×200)Fig.2 Morphologic feature of macrophages treated with EPS and LPS was photographed using an inverted phase microscop(×200)

2.4 EPS对腹腔来源巨噬细胞生成NO的影响如图5所示，与空白对照组相比，不同浓度的EPS均能显著地促进腹腔巨噬细胞分泌NO(P＜0.05);EPS在350～450 μg/ml浓度范围内，腹腔巨噬细胞分泌NO的量是先增多后减少，EPS浓度为400 μg/ml时J774A.1和原代腹腔巨噬细胞分泌NO量分别达到最大值(28.191 ±0.697)μmol/L 和(25.969 ±0.587)μmol/L。脂多糖能够促进腹腔巨噬细胞产生大量的NO;与单独脂多糖组相比，不同浓度的EPS均能抑制由10 μg/ml脂多糖诱导的NO的分泌，450 μg/ml浓度的 EPS对 J774A.1和原代腹腔巨噬细胞产生NO的抑制率最高或抑制作用最强。

图3 EPS对腹腔来源巨噬细胞分泌促炎症因子TNF-α的影响Fig.3 Production of the proinflammatory factor TNF-α in culture supernatants of macrophages treated with EPS

图4 EPS对腹腔来源巨噬细胞分泌抗炎症因子IL-10的影响Fig.4 Production of the anti-inflammatory factor IL-10 in culture supernatants of macrophages treated with EPS

图5 EPS对腹腔来源巨噬细胞生成NO的影响Fig.5 Production of nitric oxide in culture supernatants of macrophages treated with EPS

3 讨论

巨噬细胞在炎症反应中发挥重要作用，其产生的多种细胞因子和炎症介质是炎症反应发生、发展、协调和消散的内在机制［5］。TNF-α是细胞因子网络的启动因子，在炎症反应中TNF-α不仅能直接参与炎症反应，还能诱导其他细胞因子释放，共同对组织造成损伤［6］。它与其他细胞因子形成相互作用的信号网络，刺激细胞合成，表达IL-1β。IL-1β和TNF-α通过协调作用诱发炎症反应［7］。IL-10能够抑制单核巨噬细胞释放炎症介质，抑制LPS所致的TNF-α、IL-1β、IL-6和 NO 的分泌。此外，它能增强抗炎症因子的释放，如IL-1受体拮抗剂和溶解性TNF-α受体［8］。因此IL-10对机体维持稳态平衡发挥重要的作用。NO是激活的巨噬细胞杀灭病原微生物及肿瘤细胞的主要效应分子，能提高机体免疫，但过量的NO也会促进炎症发生，诱导炎症细胞因子如 TNF-α、IL-1β等。在炎症反应初期，适量的TNF-α、NO是机体对抗炎症的积极反应，但是如果它们持续不断地释放则会导致炎症的不断扩大、加重。所以，保持适量的 TNF-α、NO和IL-10等细胞因子对机体稳态平衡具有重要作用。

近年来大量的研究都集中在真菌多糖、植物多糖对巨噬细胞的单方向调节作用，而食品级乳酸菌胞外多糖对巨噬细胞的双向调节机制未见报道。Anwei Cheng［1，9］等研究发现乌拉尔甘草多糖能够促进巨噬细胞分泌炎症因子IL-6、IL-12和NO，而LPS能够促使巨噬细胞分泌过量的炎症因子IL-6、IL-12和NO而引发炎症反应。寻找一种能够双向调节巨噬细胞活性，改善炎症反应，维持免疫系统平衡的物质将是现在以及未来的研究热点。

李敏等［10］研究发现，巨噬细胞受IFN-γ等细胞因子和LPS诱导活化后，会合成并释放大量TNF-α、IL-1β、IL-6和NO等炎症介质，加重机体的炎症反应，对组织器官造成损伤。此时就需要抑制促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和 NO 等的过度释放，并且要促进抑炎症因子如IL-10等的释放，调节并维持机体的稳态平衡。本研究中，EPS激活正常的腹腔巨噬细胞，促进TNF-α、NO及少量的IL-10产生，活化细胞杀灭病原微生物，发挥积极作用。LPS诱导巨噬细胞后，TNF-α和NO的分泌增加，IL-10分泌急剧减少，加重机体的炎症反应。EPS能抑制经LPS处理后巨噬细胞的活化，维持免疫系统的平衡，因此EPS可能是LPS的抑制剂，EPS可能影响LPS的结构，也有可能EPS和LPS相互作用，发生了化学反应形成了一种新的物质，LPS和EPS之间的相互作用还有待于进一步深入研究。

本研究发现EPS能够促进正常巨噬细胞增殖活化并释放TNF-α、NO和IL-10，增强机体免疫力。当巨噬细胞受LPS诱导活化后，EPS会使TNF-α、NO分泌减少，促进IL-10的产生，表明EPS可以通过抑制TNF-α和NO的产生，促进IL-10的产生发挥抗炎作用，进一步揭示了干酪乳杆菌胞外多糖通过体外影响腹腔巨噬细胞的作用发挥其调节免疫的机制。

1 Igor A Schepetkin，Gang Xie，Liliya N Kirpotina.Macrophage immunmodulatory activity of polysaccharides isolated from Opuntia polyacantha［J］.Int Immunopharmacol，2008;8(10):1455-1466.

2 Libby P，Ridker P M，Maseri A.Inflammation and atherosclerosis［J］.Circulation，2002;105(9):1135-1143.

3 Song J Y，Han S K，Son E H et al.Induction of secretory and tumoricidal activities in peritoneal macrophages by ginsan［J］.Int Immunopharmacol，2002;2(7):857-865.

4 Jung A Byun，Mi Hyun Ryu，Jong Kwon Lee.The immunomodulatory effects of 3-monochloro-1，2-propanediol on murine splenocyte and peritoneal macrophage function in vitro［J］.Toxicol In Vitro，2006;20(3):272-278.

5 Jin-Yuarn Lin，Ching-Yin Tang.Strawberry，loquat，mulberry，and bitter melon juices exhibit prophylactic effects on LPS-induced inflammation using murine peritoneal macrophages［J］.Food Chem，2008;107(4):1587-1596.

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7 庞广昌.食品免疫论-关于胃肠黏膜免疫和细胞因子网络的科学［M］.北京:科学出版社，2008:479-487.

8 张学军，崔雪玲，劳风学 et al.激活素A对小鼠巨噬细胞分泌IL-1β的影响［J］.中国免疫学杂志，2005;21(8):575-578.

9 Anwei Cheng，Fachun Wan，Jiaqi Wang et al.Macrophage immunomodulatory activity of polysaccharides isolated from Glycyrrhiza uralensis fish ［J］.Int Immunopharmacol，2008;8(1):43-50.

10 李 敏，刘耕陶.双环醇对脂多糖诱导巨噬细胞iNOS蛋白的表达和NF-κB活化的抑制作用［J］.中国药理学通报，2006;22(12):1438-1443.