小鼠胚胎发育过程中N-Cadherin异常表达对大脑皮层神经元迁移的影响①

付苏雷 杨慈清 贾阳阳 李 晗 郭志坤 林俊堂

(新乡医学院生命科学技术学院，新乡453003)

高等动物的大脑皮层是一个高度组织、由多层神经细胞构成的复合体，神经发生始于胚胎期的室管膜区和室管膜下区，此处的神经干细胞增殖分化为神经前体细胞，再向外迁移逐步分化和成熟形成皮层板的各层神经元细胞。这种迁移是一个神经元由内至外的装配过程，即inside-out的过程［1］，这个发育过程受到严格的调控以确保建立正确的、有功能的大脑皮层。一旦皮层发育异常，特别是神经元迁移异常，就会对大脑功能产生影响，造成诸如精神分裂症、癫痫、自闭症等多种疾病。

神经钙黏蛋白(Neural cadherin，N-Cadherin)最先在鸡胚胎神经管中被发现，是钙黏连蛋白家族中第一个在中枢神经系统发现的成员。有研究表明，N-Cadherin介导了细胞间黏附及信号转导，具有识别细胞、调控组织器官形态发生等生物学功能。Tan等［2］发现神经电活动依赖的树突形态发生需要NCadherin介导的神经元之间的相互作用，并且NCadherin依赖的神经元之间的相互接触在新生树突维持过程中具有特异作用。Masakazu等［3］通过条件性基因敲除小鼠证明N-Cadherin沉默后的小鼠大脑皮层没有明显的层状结构，出现分层混乱的现象。本实验利用小鼠活体子宫内电转基因(In utero electroporation，IUE)技术，将鸡源性的 N-Cadherin转染到E15胎鼠的大脑皮层，实现异源性N-Cadherin的超表达，结合RNA干扰技术实现N-Cadherin的抑制表达，用GFP作为示踪，采用荧光免疫组化综合分析N-Cadherin异常表达对小鼠胚胎发育过程大脑皮层神经元迁移的影响，为研究N-Cadherin在中枢神经系统中的功能提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 本实验所用小鼠由新乡医学院动物中心提供;鸡源pCAGGS-N-Cadherin真核表达质粒和pCAGGS-GFP(绿色荧光蛋白)质粒由Redies教授馈赠，shRNA干扰载体pGPU/GFP/Neomouse-N-Cadherin-shRNA由百奇生物科技有限公司合成构建，DAPI购自罗氏公司，Rabbit anti N-Cadherin抗体(识别鸡源组织)由Redies教授馈赠;二抗为Goat anti Rabbit Cy3标记(Molecular Probes);CUY-21型多功能活体电转化仪(日本 NEPA公司);M205FA型倒置体视荧光显微镜(德国 Leica公司);Nikon ECLIPSE 80i荧光显微镜(日本);CM1850型冷冻切片机(德国Leica公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 同源性比较 从Genbank数据库中查到小鼠 N-Cadherin(NCBI No.NM_007664.4)的 CDS序列有2 721 bp，其对应的氨基酸为906个;鸡N-Cadherin(NCBI No.NM_001001615.1)的 CDS序列有2 739 bp，其对应的氨基酸为912个，且与本实验所用真核表达质粒pCAGGS-N-Cadherin中N-Cadherin序列一致。利用DNAman7.0生物软件比较两物种N-Cadherin的CDS序列和氨基端序列同源性。

1.2.2 小鼠子宫内电转 将健康成年小鼠雌雄各1只于第一天晚上7点合笼，第二天早上7点检查雌鼠是否有阴道栓，有阴道栓记为怀孕0.5天(胎鼠E0.5)，第三天 7点记为怀孕 1.5天(胎鼠E1.5)，以此类推。取怀孕15天的小鼠进行实验，将孕鼠用4.3%的水合氯醛按照0.01 ml/g体重腹腔注射，注射时避免扎到胚胎;约5分钟后小鼠被麻醉，剔除腹部中线附近被毛，然后腹部朝上固定于超净工作台内37℃加热垫的手术垫单上，用75%的酒精棉球和碘酒给孕鼠腹部彻底消毒，用无菌的手术器械沿腹中线剪开一个大约2～3 cm长的小口，取出两侧子宫，并不断在子宫上滴加37℃已加抗生素的生理盐水，保持子宫湿润;用显微注射毛细玻璃针吸取准备好的质粒0.5～1 μl准确注射到胎鼠侧脑室，再把电转仪板状电极的正负两极分别放在胎鼠的左右脑，正极在拟转基因一侧;使用电转仪进行电击，电转电压35 V，每次电击时间60 ms，间隔时间600 ms，电脉冲数5次，从子宫颈口胚胎向两侧计数，记录转染胚胎位置，每侧子宫转染1～2个胚胎，转染完成后把子宫放回腹腔，将创口缝合并放在37℃加热垫上，手术2～3小时后小鼠恢复清醒。小鼠存活5天后，将其处死，根据记录位置，取出转染胚胎，在体视荧光显微镜下观察结果，电转部位呈现绿色荧光者(GFP颜色)视为阳性。

1.2.3 取材及切片 取体视荧光显微镜下观察为阳性表达的胚胎，在普通体视显微镜下，采用尖头镊子小心去除皮肤和脑骨膜，用脑小铲从脑干向嗅球的方向完整取出整个脑组织，转移至4℃预冷处理的PBS液漂洗2～3次，浸没于装有4%PFA(多聚甲醛)的EP管中，置保温盒冰块中摇床摇晃过夜，次日取出组织，吸干液体，转移到18%蔗糖溶液置冰盒中摇晃过夜，待组织沉淀到管底时取出组织吸干液体，根据组织大小，用锡箔纸做好模型，用OCT包埋，注意方向，嗅球朝上脑干朝下，确定好位置，置于液氮中冷冻后放－80℃冰箱保存，切片时取出已包埋的组织，在冰冻切片机上冠状连续切片，厚度20 μm，切片后置烤片机上，37℃烤片30分钟以上，放－80℃冰箱保存备用。

1.2.4 荧光免疫组织化学染色 从－80℃冰箱中取出冰冻切片40℃干燥20分钟，4%PFA中4℃固定15分钟，用1×TBS清洗3次，每次5分钟，在含0.1%Triton X-100的1×TBS中再孵育5分钟。每张载玻片上加1 ml免疫组化封闭液，湿盒中孵育1小时。去除封闭液后每张载玻片加300 μl用封闭液稀释的合适浓度Rabbit anti N-Cadherin(1∶500)一抗，4℃孵育过夜后，1×TBS清洗3次，每次5分钟，然后每张片加300 μl用封闭液稀释的Cy3标记的Goat anti Rabbit二抗，室温孵育1小时后，用1×TBS清洗3次，每次5分钟。最后滴加DAPI封片剂染色10分钟，加盖玻片，在荧光显微镜下观察拍照。

1.3 图像处理分析 用Photoshop CS3软件处理图片，可将2种染色同位叠加在一起，从而分析蛋白质的表达定位。

2 结果

2.1 鸡源与鼠源N-cadherin同源性比较结果 借助DNAman7.0生物软件对两物种 N-Cadherin的CDS序列和各自编码氨基端序列进行同源性比较，同源相似性分别为77.25%和85.42%，说明二者为来自不同物种的同源基因。

2.2 鸡源性N-cadherin超表达对小鼠大脑皮层发育过程神经元迁移的影响 从图(1A-C)中可以看出，在胚胎发育的E15时转染pCAGGS-GFP后，E20时取材切片，被转染GFP阳性表达的神经元从内向外迁移，大多数已迁移到皮层Ⅱ-Ⅳ层(图1B)，同时在Ⅴ-Ⅵ层也有部分神经元，在亚室管膜(Subventrical zone，SVZ)也存在大量GFP阳性表达的细胞。将鸡源性pCAGGS-N-Cadherin表达载体与pCAGGSGFP共转染后，从图(1D-F)中可以看到，鸡源性NCadherin在小鼠大脑皮层中能够实现超表达(图1D)，实验中Rabbit anti N-Cadherin单克隆抗体不能够与鼠N-Cadherin结合，图(1D)中红色标记的即为鸡源性N-Cadherin超表达结果，N-Cadherin实现超表达后E20时(图1D-F)可以看出大多数神经元已经迁移到Ⅱ-Ⅳ层，与对照组相比，GFP标记的神经元在Ⅴ-Ⅵ层和SVZ区的数量较少。

图1 活体子宫内对胎鼠大脑皮层电转N-Cadherin及其shRNAFig.1 N-Cadherin and its shRNA transfection into mouse embryonic cerebral cortex with in utero electroporation

2.3 N-cadherin抑制表达对小鼠大脑皮层发育过程神经元迁移的影响 针对小鼠N-Cadherin上的GCCTATGAAGGAACCACATGA靶序列设计shRNA干扰载体(pGPU/GFP/Neo-mouse-N-Cadherin-shRNA)，该载体自身携带有GFP报告基因，但在预实验中我们发现单独转染该载体所表达的GFP荧光非常微弱，很难检测到绿色荧光，因此我们将能强表达GFP的pCAGGS-GFP质粒与其共转，且shRNA干扰载体与 pCAGGS-GFP质粒的浓度比为8∶1，确保pCAGGS-GFP转染的细胞同时也被shRNA干扰载体转染。从图(1G-I)中可以看到，将shRNA干扰载体与pCAGGS-GFP质粒共转染后E20时，大量GFP阳性表达的细胞停留在SVZ区，很少有细胞迁移到Ⅱ-Ⅳ层，与对照组相比(图1A-C)存在明显差别。

3 讨论

本研究中利用小鼠子宫内电转基因技术将带有强启动子的真核表达载体pCAGGS-N-Cadherin和带有干扰片段的shRNA干扰载体转染到胎鼠的室管膜区，由此实现了对N-Cadherin的超表达和抑制表达。有研究表明对E10.5～E11.5胎鼠用放射性标记物标记室管膜的细胞，被标记的神经元最终大部分位于较深的板层中，在E12.5～E13.5标记的细胞，最终位于皮层中间的板层中，在E15.5～E16.5标记的细胞，最终位于皮层的第Ⅱ板层［4，5］。由于是对E15的胎鼠进行电转，此时的神经元应该迁移到皮层的Ⅱ～Ⅳ层，从我们实验的对照组中也可以看到同样的结果;与对照组相比，N-Cadherin超表达后促进了神经元的迁移，有更多GFP标记的神经元迁移到Ⅱ～Ⅳ层;然而N-Cadherin被干扰后阻碍了神经元的迁移，被标记神经元明显停滞在室管膜区。我们把能够强烈表达GFP的质粒与目的质粒(浓度比为1∶8)混合共转染，保证了目的质粒转染的细胞同时也被GFP质粒转染，GFP作为报告基因对观察神经元的迁移状况很方便，而且GFP的表达对胚胎的发育不存在影响［6］。在条件性基因敲除小鼠模型中N-Cadherin沉默小鼠大脑皮层出现了混乱状态，完全失去了正常的层的结构，而且皮层中有丝分裂细胞的分布也出现异常，可见N-Cadherin在神经细胞迁移过程中具有非常重要的作用［3］。但是N-Cadherin不是唯一一个对大脑皮层发育和神经元迁移起作用的分子，潘乐等［7］结合RNA干扰和子宫内电转技术研究发现DAM17对于小鼠大脑皮层发育中期神经前体细胞向外侧迁移是必需的，干扰ADAM17的表达会造成神经前体细胞滞留在脑室区和脑室下区;神经元的向外迁移分为胶质细胞依赖型和非胶质细胞依赖型两种，研究表明在非胶质细胞依赖型的神经元迁移中，Reelin调控Dap1激活Rap1，Rap1调节N-Cadherin表达，进而控制神经元的迁移和定位［8，9］;Robo4在皮层神经元的放射状迁移中具有重要的作用，上调皮层中新生神经元的Robo4表达导致新生神经元的放射状迁移出现严重缺陷［10］;可能还有很多没有被发现的分子起着重要的作用，他们共同构成一个调控网络来调控大脑皮层的发育。RNA干扰结合活体子宫内电转基因方法与基因敲除技术相比具有明显的优点:①局部受到干扰后的胚胎可以继续生长发育便于长时间观察受干扰细胞的生命活动状况，而基因敲除小鼠的靶基因整体被沉默，对于胚胎发育过程中功能必须的基因沉默常常在胚胎发育过程导致个体的死亡，使持续观察受限;②可以通过质粒混合共转染的方法特异性的研究两个及两个以上基因的相互作用;③子宫内电转基因技术可以实现基因的定时定位抑制表达，有利于在特定时间特定部位研究基因的功能。但是对于研究E12天以前与胚胎发育的相关分子，子宫内电转技术也有其缺陷，因为对怀孕不到12天的小鼠进行电转容易造成小鼠流产，很难获得成功转染的胚胎。总之，N-Cadherin作为一种细胞间同种黏附的钙依赖型跨膜糖蛋白，主要分布于神经和肌肉组织，在神经元的迁移定位、突触的形成、神经轴突的导向生长及靶向识别中起重要作用，而且在受到干扰后没有观察到明显的补偿机制，因此我们可以选择N-Cadherin作为关键分子，结合子宫内电转基因技术定时定位研究与其相关的上下游分子，进而研究皮层发育的调控网络。

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