TLR5rs5744168基因多态性与广西壮、汉族人系统性红斑狼疮的相关性研究①

吴飞云 林有坤 方 玲 袁志刚

(广西医科大学第一附属医院皮肤性病科，南宁530021)

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是典型的系统性自身免疫病，一种以自身抗体产生和免疫复合物形成为特点的自身免疫性疾病，其中经研究发现天然免疫和获得性免疫在该病发病和病程的发展中都起了重要作用［1］。有研究结果认为:SLE的易感性及临床表型与遗传因素密切相关。

Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是一类跨膜受体，通过识别并结合相应病原相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern，PAMP)，可启动激活信号转导途径，并诱导某些免疫效应分子(包括炎性细胞因子)表达。目前对TLR的研究揭示该通路系统调节着天然免疫系统与获得性免疫系统之间的平衡，TLRs对其配体的识别，不但启动了天然免疫系统，而且也激活并调控了获得性免疫系统，与免疫缺陷性疾病、异常免疫应答性疾病等疾病的发病有关［2-5］。

研究表明细菌鞭毛蛋白可以被人TLR5识别［6］。还有研究表明，TLR5的缺乏与防护非感染性炎症有关［7］。对SLE遗传学研究显示共有50个左右基因位点与SLE有关，其中包括1q41-q42，这正好是TLR5基因所在位点［8］。Hawn等［9］在遗传不平衡测试基础上设计病例对照研究，对高加索包含199个病人和他们未患病的75名兄弟姐妹及326名父母的家系进行研究，发现TLR5基因的C1174T(rs5744168)单核苷酸多态性与防护SLE有关，推测TLR5基因+1174等位基因C是系统性红斑狼疮的危险因素，而等位基因T是系统性红斑狼疮的保护因素;但另一项针对美国高加索病人的研究则未能证实这一结论［10］。以上提示TLR5及其rs5744168位点基因多态性在SLE致病中可能起一定的作用，并且这种作用可能会有种族差异，但是否与广西壮族SLE相关，并且在广西壮族SLE和广西汉族SLE之间是否有差异有待证实，本文将对此进行研究。

1 对象与方法

1.1 对象

1.1.1 研究对象 观察组77例SLE患者为2010年5月至2011年8月广西医科大学第一附属医院皮肤性病科住院病人，所有观察病例均具有典型的临床疾病表现，均符合1997年美国风湿病学会制定的SLE诊断标准。对照组72例系我院健康体检者，经病史、体检及结合相关实验室检查排除1型糖尿病以及类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫病。所有研究对象对本研究知情同意，并签有知情同意书，均为无亲缘关系的壮族或汉族人，均为广西籍人且三代内均为纯壮族或汉族血统。观察组和对照组构成如表1。

1.1.2 仪器和试剂 百泰克全血基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型);BioTeke，2×Power Taq PCR Master Mix;百泰克，DNA 50 bp Marker;TIANGEN 6×DNA电泳Loading Buffer;上海生工，溴化乙锭;德国 Biometru，Tpersonal PCR 仪。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集受检者静脉血2 ml，EDTA抗凝，百泰克全血基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取白细胞基因组DNA，溶于洗脱缓冲液EB，－80℃保存。

1.2.2 引物设计 参照 GenBank中 TLR5 DNA序列primer5.0设计引物(序列见表2)，由上海生工生物工程技术公司合成。

表1 观察组和对照组构成表Tab.1 Table of observation groups and control groups component

表2 TLR5 rs5744168基因引物序列Tab.2 TLR5 rs5744168 gene primer sequence

1.2.3 PCR扩增条件 PCR反应体系总体积50 μl，其中模板 DNA 6 μl，2 ×Power Taq PCR Master Mix 25 μl，上下游引物各 2 μl，用灭菌双蒸水补足至 50 μl。PCR反应循环参数:95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，54℃的退火温度复性30秒，72℃延伸45秒，40个循环，最后72℃延伸10分钟。以上反应均在德国Biometru Tpersonal型的基因扩增仪上完成。

1.2.4 扩增产物直接序列测定 PCR扩增产物送上海英骏生物技术有限公司广州分公司进行序列测定。

1.3 统计学处理 计算各组基因型和等位基因频率，然后多态性位点基因型频率和等位基因频率比较采用SPSS13.0统计软件进行卡方检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。在病例组中按ds-DNA阳性与ds-DNA阴性、ANA阳性与ANA阴性、有无肾损害时TLR5rs5744168多态性位点的等位基因和基因型频率分布情况，校正了性别、年龄等混杂因素后，用卡方检验分析TLR5rs5744168多态性与SLE临床表现形式与实验室检查的相关性，以P＜0.05为具有统计学意义，使用SPSS13.0统计软件进行统计分析。

2 结果

2.1 样本DNA的提取结果 全血提取的DNA，均能跑出单一的亮的条带，如图1。

图1 DNA电泳图Fig.1 Agarose gel analysis of the extracted DNA

2.2 PCR产物电泳结果 DNA进行PCR后均能看到409 bp的亮的目的条带，如图2。

图2 TLR5 rs5744168 PCR产物电泳图Fig.2 The amplification results of TLR5 rs5744168 gene PCR products analyzed on agarose gel

2.3 PCR产物测序结果 扩增产物直接序列测定的结果，如图3和图4。

图3 TLR5 rs5744168 C/C基因型扩增产物测序图(下划线为C等位基因)Fig.3 The sequencing fig of amplified products of TLR5 rs5744168C/C genotype(Underscore for the C allele)

图4 TLR5 rs5744168 C/T基因型扩增产物测序图(下划线为T等位基因)Fig.4 The sequencing fig of amplified products of TLR5 rs5744168 C/T genotype(Underscore for the T allele)

2.4 统计分析结果

2.4.1 广西壮族 SLE与汉族 SLE的TLR5 rs574 4168 C/T多态性的差异性分析 TLR5 rs5744168C/T基因型频率以及相应的C、T等位基因频率，在两个观察组间、两个观察组与相应对照组间的差异均没有统计学意义(均P＞0.05)。见表3、4。

2.4.2 TLR5 rs5744168多态性位点与广西SLE患者的临床表现形式与实验室检查的关联性分析 表5显示了在病例组中按ds-DNA阳性与ds-DNA阴性、ANA阳性与 ANA阴性、有无肾损害时 TLR5 rs5744168多态性位点的等位基因频率和基因型频率分布情况。校正了性别、年龄等混杂因素后，用卡方检验分析显示，TLR5rs5744168这一SNP位点与ds-DNA、ANA和有无肾损害的发生间均不存在差异性(P ＞0.05)。

表3 广西壮、汉族SLE组TLR5 rs5744168基因型频率及等位基因频率分析对比Tab.3 The contrastive analysis of TLR5 rs5744168 genotype frequency and allele frequency in patients with SLE between Guangxi Zhuang nationality and Han nationality

表4 广西壮、汉族SLE组与壮、汉族对照组TLR5 rs5744168基因型频率及等位基因频率分析对比Tab.4 The contrastive analysis of TLR5 rs5744168 genotype frequency and allele frequency between Guangxi Zhuang and Zhuang control groups and between Han SLE group and Han control groups

表5 TLR5 rs5744168的基因多态性与广西SLE患者相关临床表型、实验室检查的相关性分析Tab.5 The correlative analysis of TLR5 rs5744168 gene polymorphism and the related clinical phenotypes and laboratory examination of Guangxi patients with SLE

3 讨论

目前SLE病因及发病机理尚未明确，致病因素可能有很多种，但是免疫遗传因素在其发病中的作用已经得到学界的广泛认同。在天然免疫中，宿主通过TLR5识别细菌的鞭毛蛋白(病原相关分子模式PAMPs)来介导免疫应答的产生及相关细胞因子的分泌。有研究表明，TLR5具有TLR同源域，可与CD4胞外区融合，造成TLR5组成性激活，进而激烈激活核转录因子 κB(Nuclear factor κB，NF-κB)，诱导肿瘤坏死因子 α(Tumour necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素6(Interleukin 6，IL-6)、白介素8(IL-8)的分泌。TLR5属于限制性Toll样受体，主要表达于单核/巨噬细胞、未成熟树突状细胞(Dendritic cell，DC)和上皮细胞。而研究表明，DC与自身免疫性疾病的发生关系密切。

已知TLR5基因内存在多个能引起氨基酸发生改变的SNP位点，尤其是外显子6中能导致无义突变的位点rs5744168，可引起TLR5的跨膜结构域和胞内部分的完全缺失，从而引起TLR5功能的丧失。Hawn等［9］发现TLR5 基因的C1174T(rs5744168)单核苷酸多态性与防护SLE有关，推测TLR5基因+1174等位基因C是SLE的危险因素，而等位基因T是SLE的保护因素。而Demirci［10］研究表明 TLR5基因rs5744168的基因多态性与SLE的危险性或保护性并不存在关联性。由此我们推测，TLR5的遗传变异很可能会影响SLE的发生风险和病程进展，并存在种族差异。

我们采用聚合酶链反应和直接测序法对33例壮族、44例汉族SLE患者和72名壮汉族健康对照者进行检测，结果发现TLR5 rs5744168 C/T基因型频率和等位基因频率均与广西地区的壮、汉族SLE的发生风险或保护性无关，也不存在民族间的差异性，与 Demirci［10］和 Sanchez［11］等的研究结果相吻合，但是与Hawn［9］等的研究结果相反。我们还发现TLR5 rs5744168这一SNP位点与广西SLE是否ds-DNA阳性、ANA阳性和有无肾损害的发生间亦均不存在相关性，提示该位点与本区域内SLE疾病进展可能没有相关性。但此结果不能排除与观察的病例数偏少有关，因此TLR5基因多态性与广西壮汉族SLE易感性间的确切关联还有待进一步研究。

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3 Haggqvist B，Hultman P.Effects of deviating the thresponse in murine mercury induced autoimmunity towards a thresponse［J］.Clin Exp Immunol，2003;134(2):202-209.

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5 Krieg A M.CpG DNA:a pathogenic factor in systemic lupis erythematosus［J］.J Clin Immunol，1995;15(6):284-292.

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7 Wakeland E K，Liu K，Graham R R et al.Delineating the genetic basis of systemic lupus erythematosus［J］.Immunity，2001;15(3):397-408.

8 Graham R R，Langefeld C D，Gaffney P M et al.Genetic linkage and transmission disequilibrium of marker haplotypes at chromosome 1q41 in human systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Res，2001;3(5):299-305.

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10 Demirci F Y，Manzi S，Ramsey-Goldman R et al.Association study of Toll-like receptor 5(TLR5)and Toll-like receptor 9(TLR9)polymorphisms in systemic lupus erythematosus［J］.J Rheumatol，2007;34(8):1708-1711.

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