吉林省汉族154例正常人HLA-Cw及KIR基因型频率的分析

韩 瑜 焦立新 马 宁 赵 令 姜振宇②

(长春市中心血站，长春130031)

杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer cell immunoglobulin-like recepor，KIR)是表达于 NK细胞和部分活化T细胞的表面的糖蛋白［1］。KIR分为两大类:刺激性KIR(sKIR)和抑制性KIR(iKIR)。

HLA-Cw广泛分布于人体组织细胞，可被KIR特异性识别，参与调控NK细胞杀伤功能，是NK细胞赖以识别自我与非我的分子基础之一。同一HLA-Cw分子与不同的KIR结合后，可以产生不同的信号，激活或抑制NK细胞的杀伤功能［2］。观察表明，个体的HLA-Cw与其sKIR或iKIR的组合形式存在差异，这种差异不但可以影响对疾病的易感性，还可以影响疾病的进展［3，4］。为了解中国人不同地区HLA-Cw与KIR的识别方式，我们应用PCRSSP技术，检测了154例长期居住于吉林地区的汉族健康人的KIR及其HLA-Cw配体的基因型频率，分析HLA-Cw与KIR受体在吉林地区的识别情况，为今后研究其在人群遗传学和它在疾病中的作用提供理论基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象 154名吉林汉族健康人，均系长期居住于吉林省长春地区，其祖辈三代以上均系汉族。男84名，女70名;年龄21～50岁，均为无血缘关系的无偿献血者。征其同意后抽取外周静脉血5 ml，放于含有EDTA抗凝剂试管，保存-80℃冰箱备用。

1.2 基因组DNA提取 采用TIANamp Blood DNA Kit试剂盒，按照试剂盒的操作说明书进行基因组DNA的提取。DNA浓度≥80 mg/L，纯度为A260/280=1.65～1.90之间。

1.3 引物合成 参照文献［5］方法合成扩增 KIR基因的 PCR-SSP分型法引物(表1)，反应1～15的内对照引物为 FGH(5'-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3')和RGH(5'-TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3')，扩增产物长度429 bp;反应16的内对照引物为DRB1-F(5'-TGCCAAGTGGAGCACCCAA-3')，DRB1-R(5'-GCATCTTGCTCTGTGCAGAT-3')扩增产物长度796 bp。HLA-Cw基因的PCR-SSP分型法的引物参照文献［6］，引物见表2。所有引物均由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成，并经过Blast验证。

1.4 KIR基因及其HLA-Cw的PCR-SSP分型 各KIR基因均采用两对KIR基因上下游引物加一对内对照引物体系，而HLA-Cw基因采用上下游引物加一对内对照引物体系。

1.4.1 PCR-SSP分型法扩增KIR基因 PCR-SSP反应体系及循环条件参照文献［5］方法进行。

1.4.2 PCR-SSP分型法扩增HLA-Cw基因 PCRSSP反应体系及循环条件参照文献［6］方法进行。

1.5 统计学处理 统计学分析参照文献［5］方法，HLA-Cw与KIR在吉林汉族人群中的出现频率和基因型频率。KIR基因出现频率(F)通过直接计数测得，pf(%)=阳性基因数/研究组总人数;KIR 基因频率的计算公式:

2 结果

2.1 KIR基因的电泳结果 KIR基因常规扩增后经电泳分析，结果显示目的片段的大小与预期结果相符(图1)。反应孔1 ～14，16的内对照为 GH，片段长度429 bp;反应孔15的内对照DRB1片段长度796 bp。

表1 KIR引物序列Tab.1 Primers used for KIR genotyping by PCR-SSP

表2 HLA-Cw引物序列Tab.2 Primers used for HLA-Cw genotyping by PCR-SSP

图1 KIR基因的PCR-SSP分型结果Fig.1 The results of KIR genotyping by PCR-SSP

图2 HLA-Cw基因的PCR-SSP分型结果Fig.2 The results of HLA-Cw genotyping by PCR-SSP

2.2 HLA-Cw基因的电泳结果 HLA-Cw基因常规扩增后经电泳分析，结果显示:目的片段的大小与预期结果相符(图2)。反应孔 C1、C2的内对照为GH，片段长度429 bp。

2.3 HLA-Cw与KIR在吉林汉族人群中的出现型和基因型频率。两者的结果见表3。

2.4 HLA-Cw与KIR的识别情况 KIR分为两大类:刺激性KIR(sKIR)和抑制性KIR(iKIR)。抑制基因KIR2DL1、2DL2和2DL3的配体是HLA-C。根据结合重链80号位点氨基酸的不同，HLA-C又分为两组。80号位点是天冬氨酸的为HLA-C2组;80号位点是赖氨酸的为HLA-C1组。KIR 2DL1的配体是 HLA-C2，KIR2DL2/2DL3的配体是HLA-C1［7］。

HLA-C1Asn80的表达频率为79.87%，远高于HLA-C2Lys80的表达频率27.92%。表4显示了HLACw与KIR刺激性配对和抑制性配对的组合在吉林汉族人群中的分布。HLA-C2Lys80+2DL1的组合频率最高为27.27%，其次分别HLA-C1Asn80+2DL2/2DL3为 68.83%，2DS2+HLA-C1Asn80为 9.74%，2DS1+HLA-C2Lys80为9.74%。分别有72.08%和21.43%的观察对象表达KIR2DL1、KIR2DS1而无相应HLA-Cw表达;21.43%的个体表达KIR2DS1而不表达HLA-Cwlys-KIR2DL1配对。2.60% 的个体表达KIR2DS2而不表达HLA-Cwasn-KIR2DL2/L3配对。

表3 HLA-Cw与KIR在吉林汉族人群中的表现型和基因型频率Tab.3 Phenotype and genotype frequency of KIR and HLA-Cw of Jilin Han population

表4 HLA-Cw与KIR刺激性配对和抑制性配对的组合在吉林汉族人群中的分布Tab.4 The combined frequencies of diffencent compound KIR-HLA genetypes in Jilin Han population

3 讨论

KIR通过识别人类白细胞抗原HLA-Ⅰ 类分子调控效应细胞活性，启动免疫过程，调节细胞因子分泌。KIR的配体主要为HLA-Ⅰ类抗原，不同的KIR受体识别不同的HLA，并进一步判别对象属于“自我”或“非我”，从而发挥其免疫调节作用［8，9］。

NK细胞能够识别被病毒感染的组织细胞和肿瘤细胞，通过细胞毒作用裂解靶细胞或分泌细胞因子来调节免疫反应，因此它构成了人体免疫系统的第一道屏障［10，11］。不成熟的NK细胞经过主要组织相容性复合体HLA-I类分子的“教育”才能变为成熟的 NK细胞［12］。NK细胞通过其膜表面的抑制受体和活化受体精确的调整其功能状态。在长期的进化过程中，KIR和HLA共同进化，相互选择逐步形成现在高效和精确的受/配体系统［13］。最近，Kouyuki等［14］在对477例疟疾患者的研究中发现脑型疟疾患者中的KIR2DL3基因和其配体HLA-C1的组合与非脑型疟疾患者相比较有较强的关联性。进一步的研究更是发现KIR2DL3-HLA-C1的组合形式在疟疾高发人群中保持着较低的频率。

由此可见，KIR和HLA的受/配体系统在调节NK细胞的功能方面发挥着重要的作用，因此，确定HLA-Cw与KIR的识别情况就显得尤为重要。我们在对吉林汉族人群154例个体进行KIR及HLA-Cw分型结果显示，HLA-C1Asn80的表达频率为79.87%，低于广东汉族的97.5%和伊朗人群的76%［6，15］。吉林汉族HLA-C2Lys80的表达频率27.92%与广东汉族人群的频率相当［15］，但是都低于伊朗人群的频率［6］。广东汉族人 群 的 HLA-C1Asn80的频率为97.5%［15］，远高于吉林汉族的79.87%。吉林汉族人群KIR受体和其配体的组合频率与其它地区人群比较基本相同，吉林汉族人群KIR2DS2+HLAC1Asn80的频率为9.74%，低于广东汉族14%和中东的伊朗的 21.5%［6，15］。而吉林汉族人群 HLA-C1 C1Asn80+KIR2DL2/2DL3的频率为68.83%，高于广东汉族的41.8%和中东伊朗的6.5%［6，15］。这些可能是由于HLA和KIR的种族和地区差异所造成。

在对吉林汉族人群的154例个体研究中，我们还发现有9.74%和9.74%的个体仅表达2DS2+HLAC1Asn80和2DS1+HLA-C2Lys80的活化性受配体对组合。对于这些个体，由于抑制信号不能完全阻断活化信号的传递，因此此类个体的NK细胞可能攻击自身的组织细胞，产生自身免疫性疾病［4］。这还有待于今后更多大样本实验和临床患者实验的证实。

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