不同品牌卷烟主流烟气亚硝胺、氢氰酸释放量与卷烟有害生物效应关系

苏利霞,杨华武,赵 瑜,朱卓越 ,陈 雄,杨陟华,朱茂祥

(1.湖南中烟工业有限责任公司技术中心,中国 长沙 410014； 2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，中国 北京 100850)

烟草作为一种特殊商品，满足了消费者生理和心理方面的需要，但流行病学调查结果显示吸烟对人体健康有一定影响．随着研究的深入，医学界对吸烟与健康的影响也产生了迷惑与分歧，吸烟对健康的危害变得模棱两可[1]．众所周知，吸烟对人体健康的影响最终是体现在生物体上[2]，建立生物指标来检测和评价卷烟对生物体的效应，对低危害卷烟产品的前期开发和卷烟安全性评价是很有意义的．作者采用离体细胞培养的方法来检测烟气浓缩物的细胞毒性、动式被动吸烟小鼠急性毒性试验来检测烟气的急性毒性，共测定国内外20个不同品牌的卷烟[3]，试验采用2个生物学指标：细胞死亡率和小鼠半数死亡时间，将该数据制成加权数值表，来初步评价卷烟烟气的有害生物效应和烟气中的亚硝胺、氢氰酸含量的相关性．

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用烟采用在市面上随机抽样提供，每支烟质量为0.90～0.92 g．

1.2 主要试剂

无血清的LHC-12 培养液(Gibco 公司)，LHC基础培养液(Biofluids Biobource INC)，胰蛋白酶(Gibco 公司)，胎牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma 公司)，噻唑兰(MTT，Amersham LIFE SCIENCE)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)(Sigma 公司)，乙腈(Merck公司)，乙酸(Merck公司)，乙酸胺(Merck公司)，其余均为市售分析纯试剂．

1.3 主要实验仪器

JJD100 型单通道吸烟机(郑州烟草研究所)，MOODEL 2300 CO2孵箱(Sheldon制造有限公司)，月坛牌洁净工作台(北京冠鹏净化设备有限公司)，TDL-5T台式离心机(重庆光学仪器厂)，LXJ-64-01型离心机(北京医疗仪器修理厂)，KUBOTA 6930型低温离心机(久保田商事株式会社)，Thermo Forma低温冰箱(Thermo Electron 公司)，MCC/340 P酶标仪(Multiakan公司), HH-SY21-Ni4C型电热恒温水浴锅(北经长风仪器仪表公司), SARTORIUS BS210S型电子天平(北京赛多利斯天平有限公司),API3000液相色谱串联四极杆质谱仪(AB SCIEX公司)．AAⅢ型连速流动分析仪(德国BRAN&RU BBE公司)．

1.4 细胞培养

永生化人支气管上皮细胞系BEP2D，以LHC-8无血清培养液(LHC-8 SERUM-FREE MEDIUM with GLUTAMINE)培养,接种于25 cm2或75 cm2的培养瓶内，以95%相对湿度、体积分数为5%(下同)的CO2、37 ℃在培养箱内孵育；细胞每周传代1次，传代后2天换1次液．

1.5 卷烟烟气凝集物(CSC)制备

JJD100 型单通道吸烟机设定为1 口/min，分别经过5 mL 有机相(95%的乙醇) 和5 mL 无机相(LHC-12 培养液)收集20 支卷烟的烟气，分装后于-80 ℃贮存备用．

1.6 MTT 法检测

把培育的细胞用微孔滤膜过滤除菌后，以LHC-8培养液稀释至所需浓度进行染毒．收集处于指数生长的BEP-2D细胞，按109个/L接种96孔培养板中，其中1排孔作为阴性对照，不作任何处理；另1排孔作为空白对照，分别进行试验烟和对照烟的细胞染毒，每种卷烟设计10个染毒剂量．用2.5 g/L胰蛋白酶消化BEP2D细胞,并且准确计数．然后用LHC-8培养液稀释单个细胞悬液，以每孔8 000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL;将培养板移入CO2孵箱中，在37 ℃、5%CO2和95%相对湿度条件下，培养24 h；然后以不同浓度CSC 对细胞染毒，每个剂量设4个平行样，终体积仍保持200 μL， 染毒培养72 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL,37 ℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO,震荡10 min,使结晶物充分溶解．选择570 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔OD值，记录结果[4]．

1.7 TSNA含量检测

将收集了主流烟气粒相物的滤片置于小玻璃瓶中，加入100 μL 5 mg/L的内标混合溶液和10 mL的0.1 mol/L乙酸铵水溶液，封好玻璃瓶，置于回旋震荡器上以180 r/min转速振荡萃取30 min；分别用1 mL 的甲醇和水先后润洗固相萃取小柱，移取1.0 mL萃取液，用120 μL的1.0 mol/L的氢氧化钠溶液将萃取液调为碱性，碱性液上OASIS MCX (30 mg)固相萃取柱，用1 mL水淋洗，然后用1.0 mL 50%甲醇(体积分数)的水溶液将分析物洗脱，洗脱液装入液相进样小瓶，以备LC/MS/MS分析[5]．

1.8 HCN含量检测

按YC/T 29-1996标准抽取5支卷烟后，将收集了主流烟气粒相物的滤片置于小玻璃瓶中，加入50 mL 0.1 mol/L NaOH溶液常温下震荡30 min，用装有过滤头5 mL一次性针筒抽取滤液，装入样品瓶内进行连速流动分析；用装有30 mL 0.1 mol/L NaOH溶液的吸收瓶扑集5支卷烟主流烟气气相中的HCN，吸毕，用0.1 mol/L NaOH溶液淋洗吸收瓶与主流烟气接触的部分，合并扑集液与淋洗液，用0.1 mol/L NaOH溶液定容至50 mL，取约2 mL装入样品瓶中进行连速流动分析；根据吸光度和工作曲线计算扑集液中的HCN浓度，卷烟烟气中的HCN释放量为粒相(滤片)与气相(吸收瓶)中HCN测定量之和[6]．

1.9 统计学方法

2 结果与讨论

2.1 小鼠急性毒性暴露卷烟烟气的半数死亡时间按急毒大小排序

表1 小鼠急性毒性暴露卷烟烟气的半数死亡时间按急毒大小排序表

2.2 样品烟气浓缩物按细胞毒性大小排序

采用相同的实验条件，分别对20个不同品牌的卷烟进行动物急性毒性、细胞阈剂量及细胞半数致死剂量测定比较，进行One-Sample T Test 分析(表2),发现没有统计学协同性差异．

2.3 按加权综合毒性大小排序

采用2个生物学指标，并采用加权法来比较20个品牌的卷烟烟气的有害生物学效应，见表3．

表2 样品烟气浓缩物毒性列表(按急毒大小排序)

表3 卷烟烟气加权综合毒性列表

2.4 样品烟气浓缩物细胞生物加权综合毒性大小和烟气中的亚硝胺含量和氢氰酸含量测定结果

从表4、图1、图2中可以看出：不同品牌的卷烟烟气的有害生物学效应存在一定的差异，在进行卷烟安全性评价时，生物加权综合毒性大小与亚硝胺、氢氰酸含量没有明显的线性关系．造成这种现象的原因可能为： CSC是一种混合物，各种有害组分之间也可能是一种叠加或协同作用[9-14]，卷烟的有害生物效应与单个化合物组分的含量关系并不很密切．

表4 样品烟气浓缩物细胞生物加权综合毒性和烟气中的亚硝胺、氢氰酸含量

图1 生物加权综合毒性大小与总TSNA变化关系图Fig.1 The relationship between bio-weighted composite toxicity total with TSNA

图2 生物加权综合毒性与总HCN变化图Fig.2 The relationship between bio-weighted composite toxicity with HCN

3 小结

本实验通过对卷烟烟气冷凝物(CSC)中具有代表性的TSNA、HCN的有害成分细胞毒性进行分析，发现TSNA、HCN与 CSC都具有体外细胞毒性，但是不同品牌的卷烟烟气的有害生物学效应存在一定差异，在进行卷烟安全性评价时，生物加权综合毒性大小与亚硝胺、氢氰酸含量没有明显的线性关系．造成这种现象的原因可能为： CSC是一种混合物，各种有害组分之间可能存在一种叠加或协同作用，卷烟的有害生物效应与单个化合物组分的含量关系并不很密切．因此烟草行业和社会公众需要科学、全面、客观地评价卷烟烟气危害性，烟草行业也要致力于降低烟气中的有害成分．

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