鼠疫菌OxyR蛋白对katY的转录调控机制

倪 斌，张义全，黄新祥，杨瑞馥，周冬生

2.军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071；Email：nibinyl＠gmail.com

鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）引起的一种人兽共患病，人类通常被带菌蚤体叮咬而被感染，临床表现主要有腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫[1]。鼠疫菌在感染早期被巨噬细胞吞噬，并能在其中生存繁殖[2]，这表明鼠疫菌能通过一系列的自我调节，从而抵抗巨噬细胞内一系列杀菌物质（特别是活性过氧化物）的杀菌作用。其中，由转录调控子对特定靶基因在转录水平上的调节，起着关键的作用。

OxyR蛋白是LysR家族转录调控子之一，在细菌抗氧化过程中发挥重要作用，其分子内的两个对过氧化物敏感的半胱氨酸残基（Cys－199和Cys－208）能被氧化成二硫键，并促进其寡聚化（二聚体或四聚体）而具有转录调节活性[3]。研究表明，大肠杆菌OxyR的调控元基因大多与细菌抗氧化有关，比如dps、gorA、grxA、katG、fur、ahpCF等[4－5]；另外，OxyR还能激活小RNA基因oxyS的转录，因而OxyR又能通过OxyS调节其它基因的表达[4]。鼠疫菌OxyR蛋白也参与抗氧化调节，特别是能直接激活katY的表达[6]。鼠疫菌KatY蛋白首次发现于1956年，它是一种温度依赖型蛋白，在37。C时高表 达[6－7]。KatY分子具有4种亚型，即α－KatY（～70kDa）、β－KatY（～50kDa）、γ－KatY（～36kDa）和δ－KatY（～34kDa），小分子量的γ－和δ－亚型可能是α－或β－亚型的酶解产物[6－7]。α－与α－KatY 或α－与β－KatY能形成4聚体而具有过氧化物酶及触酶活性，进而解除过氧化物（比如H2O2）对细胞的毒害，有利于鼠疫菌在巨噬细胞内的生存[6－7]。

虽然已经证明鼠疫菌OxyR能直接激活katY的表达[6]，但是katY的转录起始位点以及OxyR与katY启动子区DNA相互作用机制并未被阐明。本文利用引物延伸实验、实时定量RT－PCR实验、凝胶阻滞（EMSA）实验以及DNase I足迹实验等经典的分子生物学实验技术，进一步完善了OxyR对katY的转录调控机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 His－OxyR蛋白表达菌、鼠疫菌201株（野生型，WT）及其oxyR突变株（ΔoxyR）等均由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 实验所用的Primer Extension System、fmol®DNA Cycle Sequencing System等为Promega产品；TRIzol Reagent为Invitrogen产品；TaqDNA连接酶、dNTPs为上海生工生物工程公司产品；PCR产物纯化试剂盒为QIAGEN产品。

1.2 鼠疫菌生长曲线的测定 取50μL甘油菌种接种于18mL的TMH[8]培养基中（50mL的三角烧瓶，加玻璃珠，下同），26。C下230r／min培养至平台期，按1∶20稀释接种至新鲜的TMH培养基中，26。C下230r／min培养至OD620≈1.0，再按1∶20稀释接种至新鲜的TMH培养基中，26。C下230r／min连续培养，并每隔3h取一次样，测其OD620的吸光度值，最后以时间为横坐标，以OD620的值为纵坐标，绘制生长曲线。

1.3 凝胶阻滞（EMSA）实验[9]PCR 扩增katY（引物序列见表1）的启动子区序列并对产物纯化回收。用T4多聚核苷酸激酶（T4PNK）和[γ－32P]ATP（5 000Ci／mmol，10mCi／mL）对DNA片段5′末端进行标记。标记的DNA和不同浓度的His－OxyR蛋白在特定的反应体系中，室温共同孵育20 min后，进行4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影后分析结果。

表1 本研究所用引物Tab.1 Oligonucleotide primers used in this study

1.4 DNase I足迹实验[9]利用[γ－32P]ATP对特异性引物（引物序列见表1）的5′末端进行标记，以鼠疫菌201株基因组DNA为模板，用被标记的引物和对应未标记的配对引物进行PCR扩增，PCR产物可作为足迹实验的探针。探针和不同量的His－OxyR蛋白在特定的结合体系中室温共同孵育30min，再用合适浓度的DNaseⅠ消化适当的时间（30～60s），消化产物配伍测序条带进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影分析结果。

1.5 引物延伸实验[10]将与katY的mRNA互补的特异性引物（表1）5′－末端用[γ－32P]ATP进行放射性标记，并将其退火到mRNA上（分别以等量的WT和ΔoxyR的总RNA为模板），进而将mRNA逆转录成cDNA。逆转录产物配伍测序条带进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影后，通过引物延伸条带的位置即可确定转录起始位点，而根据其相对丰度即可判定OxyR对katY的调控关系。

1.6 实时定量 RT－PCR[10]提取 WT 和ΔoxyR的总RNA，并用 DNA－freeTMKit（Amibion）消化去除其中的DNA污染，再用N6随机引物将其逆转录成cDNA，最后用Roche的LightCycler system作实时定量RT－PCR。将cDNA进行系列稀释，并以16SrRNA的cDNA为内参绘制标准曲线，用于katY表达水平的相对定量。

2 结 果

2.1 鼠疫菌在TMH中的生长状态 从图1可以看出：在TMH中，ΔoxyR的生长速率比 WT的稍慢，但从对数末期开始二者基本趋于一致，在24h时达到平台期，且其OD值均能达到2.0以上，这说明oxyR的缺失对鼠疫菌在TMH中的生长没有太大的影响。根据生长曲线，我们向OD620≈1.0的培养物中加入终浓度为10mmol／L过氧化氢，并继续培养30min后收集菌体，供后续的分子生化实验用。

图1 WT和ΔoxyR在TMH中的生长曲线Fig.1 Yersinia pestis growth curves Cell cultured with an OD620value of about 1.0in TMH medium were diluted 1∶20into 18mL of the corresponding fresh medium.Bacteria were then grown at 26。C with shaking at 230r／min，and the OD620values were monitored for each culture with a 3hinterval until the cultures reached the stationary phase.

2.2 OxyR能结合到katY的启动子区 在本室前期的研究中，已证明OxyR能结合到katY的启动子区[6]。本文中，首先利用EMSA实验，重复验证了OxyR蛋白对katY启动子区具有结合作用，结果如图2A）所示：随着 His－OxyR蛋白浓度的不断增加，自由DNA条带越来越弱（泳道1到4），当先向反应体系中加入未标记的katY启动子区DNA（Cold probe，第5泳道）后，由于蛋白先与Cold probe结合就不能再结合探针，这样自由条带就会增加，阻滞带就会消失或减少，而加入16SrDNA作为negative probe（第6泳道）就没有这种效应；而当只加入鼠疫菌F1抗原蛋白（Un－related protein，第7泳道）时，由于F1抗原蛋白是非调控子蛋白，它不能与katY启动子区结合，而不出现阻滞条带。上述结果表明His－OxyR蛋白对katY启动子区的结合是特异性的。

图2 EMSA实验（A）和DNaseⅠ足迹实验（B）放射自显影结果Fig.2 EMSA and DNase I footprinting assays of binding of His－OxyR to katYpromoter region

进一步利用DNaseⅠ足迹实验来确定OxyR对katY启动子区的结合位置，结果如图2B）所示：“1 2 3 4 5”为蛋白量从低到高的不同蛋白梯度，“1”为未加蛋白的参照，coding是指被标记引物是上游引物，Non－coding指被标记引物是下游引物。根据“G A T C”测序条带，我们可以得出OxyR对katY启动子区的结合位置为－101至－48之间的碱基（翻译起始位点为“＋1”），这比前期所得的结合序列长了许多[6]，但是其核心区域是一致的，其主要原因可能是探针制备方法不同所致。

2.3 OxyR激活katY的转录 我们利用引物延伸和RT－PCR实验技术研究OxyR对katY的调控关系。图3A为引物延伸结果：若以翻译起始位点为＋1，katY的转录起始位点为－26位的碱基G，且我们只在WT中检测出了引物延伸条带，而在ΔoxyR中没检测出，这表明鼠疫菌OxyR能促进katY的转录；图3B为RT－PCR结果，可以看出：WT中katY的mRNA丰度远远高于ΔoxyR中的，二者具有4倍以上的差异，这进一步表明OxyR能促进katY的转录表达。

2.4 鼠疫菌katY启动子区结构 图4为katY基因的启动子区结构示意图：包含翻译起始位点、转录起始位点 P、OxyR 结合位点、－10和－35区以及Shine－Dalgarno序列（SD序列，为核糖体识别位点）。

图3 OxyR对katY调控的引物延伸（A）和RT－PCR实验（B）结果Fig.3 OxyR activation of the transciption of katY

图4 鼠疫菌katY启动子区示意图Fig.4 Organization of katYpromoter DNA region Shown were translation and transcription starts，Shine－Dalgarno box，predicted OxyR sites，and－10and－35core promoter elements.

3 讨 论

之前的研究表明：当鼠疫菌被巨噬细胞吞噬后，katY即迅速表达，这与OxyR能直接激活katY的转录有关[6]。但是前期的研究并没有详细阐述OxyR对katY调控机制。本文中，我们利用引物延伸实验、实时定量RT－PCR、EMSA、DNase I足迹等实验技术，完善了OxyR对katY基因的转录调控机制。图4为katY启动子区结构：P为katY的转录起始位点，－10和－35区为RNA聚合酶的识别位点，Shine－Dalgarno序列为核糖体结合位置。可以看出OxyR的结合位点覆盖－35区，而不覆盖－10区，这表明OxyR对katY的激活可能是通过与RNA聚合酶σ亚基的C－末端结构域（σCTD）相互作用，从而有利于σ亚基对－10和－35区的结合而实现的。简而言之，OxyR对katY基因的激活，是通过OxyR、RNA聚合酶及katY启动子区DNA序列的共同相互作用而实现的。

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